黄瓜因其高产高效成为露地和保护地主栽蔬菜之一。近年来,黄瓜的产量和品质成为育种工作者研究的重点内容。黄瓜是鲜食和加工均可的蔬菜,采收一般在果实发育早期。因此,早期的细胞快速分裂和膨大对于果实产量是至关重要的。关于果实的研究更多的是关注果实的成熟机制和采后生理,对于果实早期发育机理,特别是细胞快速分裂和膨大期的机理尚不清楚。研究人员对黄瓜转录组数据分析中发现,在果实发育早期(8Day)细胞快速膨大过程中,细胞骨架相关蛋白在果实早期发育中表达量上调。微管蛋白是真核生物主要的细胞骨架蛋白之一,细胞内有很多微管结合蛋白,通过不同的方式结合于微管,并影响微管的结构特性,从而调节微管的功能。动蛋白(Kinesin)是一类依赖于微管的马达蛋白,在细胞有丝分裂,减数分裂,维持细胞形态和细胞器的运输方面都发挥着重要作用。有研究报道在苹果早期发育中,细胞周期蛋白Cyclin在细胞快速分裂中起重要作用,而也有研究表明细胞周期蛋白Cyclin和CDKA能够通过磷酸化下游的Kinesin来调控细胞分裂。因此推测,Kinesin很可能参与果实早期细胞快速分裂等过程。因此,关于动蛋白在黄瓜果实细胞分裂和细胞膨大过程中的作用,调控果实发育过程的分子机制都值得深入探讨。本试验通过生物信息学方法找到了黄瓜中的Kinesin基因家族,比较了不同基因型黄瓜在果实发育早期动蛋白基因表达量的变化,推测至少有8个候选动蛋白参与了此过程。对Cs KF1、Cs KF2、Cs KF3进行了功能方面的研究和细胞定位。所得主要结果如下:(1)对‘9930’果实发育早期的形态学和细胞学变化进行了研究。果实长度和果径在开花第3天到第5天出现指数级增长,果实硬度从第3天开始出现明显下降。发育早期的果实在开花第0—3天细胞数量增长率大约为200%,此后增加趋于平缓;果实横切面细胞面积在开花第0—5天增长不到2倍,而开花第5—16天时细胞面积增大了接近30倍。这些结果也揭示出了开花第3—5天是‘9930’黄瓜果实发育早期细胞从快速分裂向快速膨大的过渡时期。(2)通过生物信息学手段搜索黄瓜基因组的蛋白质库,共得到47个含有马达区(moter domain)保守结构域的动蛋白。对47个黄瓜动蛋白在‘9930’14个不同组织中进行了半定量表达分析,发现不同的动蛋白在黄瓜的根、茎、叶、果实等不同组织中表达量有明显差异,某些动蛋白在果实中的表达量明显较其他组织高。对47个黄瓜动蛋白在‘9930’果实发育早期的12个不同时间做了实时荧光定量分析发现:有12个动蛋白在果实发育早期有明显上调表达,表达水平达到最高。对这些数据进一步做了层次聚类分析,选出8个在果实发育早期特异表达的Kinesin基因。(3)对筛选出的8个Kinesin基因,在4个不同基因型黄瓜果实发育早期进行了实时荧光定量表达分析,发现其中5个动蛋白基因在4个品种上均表现出开花前3天基因表达水平上调并达到峰值,有2个动蛋白基因在4个品种中开花5天后基因表达水平上调并达到峰值。推测其中Cs KF2、Cs KF3、Cs KF4、Cs KF5和Cs KF6可能与细胞快速分裂相关,Cs KF1和Cs KF7可能与细胞膨大相关。(4)在黄瓜中克隆了Cs KF1、Cs KF2和Cs KF3共3个Kinesin基因并重点分析了基因结构等特性。在原核系统中诱导表达并纯化了His-Cs KF1-M、His-Cs KF2-M马达区蛋白,对His-Cs KF1-M和His-Cs KF2-M进行ATPase活性和微管结合特性分析:His-Cs KF1-M是依赖于ATPase活性结合到微管上的;His-Cs KF2-M具有独特的生化特性,ATPase活性可以被微管激活,但是不依赖于微管的存在与否,并且无论外源核苷酸是否存在都与微管发生共沉淀。(5)对非马达区重组蛋白His-Cs KF1-N、His-Cs KF2-C、His-Cs KF3-C在原核细胞中进行诱导表达与纯化,得到多克隆抗体anti-KF1-N、anti-KF2-C和anti-KF3-C。抗体anti-KF1-N可以在黄瓜根、叶片、芽、开花5天的果实中识别与预测Cs KF1大小相近的约80 k Da的条带;抗体anti-KF2-C可以在黄瓜叶片、芽、开花0天的果实中识别与预测Cs KF2大小相近的约125 k Da的条带;抗体anti-KF3-C在黄瓜根、茎、雄花、雌花、开花2天的果实中识别与预测Cs KF3大小相近的约110 k Da的条带。(6)用免疫荧光标记方法利用特异的抗体对Cs KF1、Cs KF2和Cs KF3在黄瓜果实进行亚细胞定位。Cs KF1定位于开花5天果实的细胞质膜上;Cs KF2绿色荧光信号主要存在于叶绿体上,进一步对胞质总蛋白、叶绿体总蛋白、叶绿体膜蛋白、基质蛋白进行免疫印迹,发现Cs KF2在叶绿体上,在叶绿体膜、基质上均有分布;对Cs KF3进行免疫荧光标记,发现其主要分布于成膜体的中间区域上。(7)利用Gateway技术构建了适用于基因枪和农杆菌转化的RNA干扰载体Cs KF1-RNAi、Cs KF2-RNAi和Cs KF3-RNAi,基因过表达载体Cs KF1-OE、Cs KF2-OE和Cs KF3-OE。