第一部分:核糖体蛋白Rpl B的乙酰化修饰及其对功能的影响真核生物的乙酰化研究已经非常广泛和深入,而在原核生物中,虽然大量蛋白质被报道有乙酰化修饰,它们几乎参与了生命活动的所有过程,例如能量代谢、RNA转录、趋化性等,但是乙酰化对蛋白质功能的影响仍然知之甚少。本部分我们通过对乙酰基转移酶Pat进行两步梯度纯化并结合乙酰化反应发现核糖体蛋白Rpl B可以被Pat乙酰化修饰,Rpl B蛋白不仅和复制起始蛋白Dna A、RNA聚合酶相互作用,而且可以和r RNA结合,是蛋白质翻译中不可或缺的蛋白质,因此为了进一步考察在大肠埃希菌中乙酰化对核糖体蛋白Rpl B功能的影响,本部分以E.coli K12菌株BW25113为研究对象,采用分子生物学、微生物学以及生物化学等方法展开了如下几部分的研究:1.我们通过GST-pulldown的方法证明Rpl B和Pat、Cob B存在相互作用,然后通过建立乙酰化与去乙酰化反应体系,直接证明了Rpl B能被Pat乙酰化修饰以及被Cob B去乙酰化修饰;由于Rpl B和r RNA的结合与蛋白上所带的正电荷密切相关,而乙酰化修饰则会中和赖氨酸所带的正电荷,因此为了考察乙酰化对Rpl B功能的影响,我们体外将乙酰化修饰和未乙酰化修饰的Rpl B和r RNA进行孵育之后跑琼脂糖凝胶电泳观察两者与r RNA的结合能力,结果显示,Rpl B被乙酰化修饰之后,与r RNA的结合能力显著下降。之后,我们对核糖体与非核糖体蛋白质的赖氨酸含量进行了分析,发现前者的含量明显高于后者,提示了乙酰化有可能影响到核糖体的组装以及翻译效率,而cob B敲除株的生长明显低于野生株也暗示了这一点。2.为了在体内考察Rpl B受Pat/Cob B乙酰化调控,我们构建了p SUMO-rpl B质粒并分别与p ET28a-cob B以及p ET28a-pat在BL21中共表达,发现与cob B共表达时Rpl B的乙酰化下降,而与pat共表达时发现其乙酰化升高,说明了Pat和Cob B在体内能对Rpl B进行乙酰化修饰;但是在BW25113与pat、cob B敲除株中表达Rpl B并比较其乙酰化差异时,发现cob B敲除株中Rpl B的乙酰化明显高于野生株,而pat敲除株Rpl B的乙酰化变化不明显,说明了还存在其它对Rpl B进行修饰的因子;最近报道称Ac P能作为乙酰基供体对蛋白质进行乙酰化修饰,当我们用Ac P对Rpl B进行处理时,发现Rpl B的乙酰化有明显的升高。3.营养饥饿条件下细菌生长受阻,为了考察在此条件下Rpl B的乙酰化是否会发生变化,我们将对数期的菌转入氮源缺失的PBS+0.5%glucose中进行饥饿处理,发现随着时间的延长,Rpl B的乙酰化逐渐增高。综上所述,核糖体蛋白Rpl B能被乙酰基转移酶Pat和去乙酰化酶Cob B共同调控,而且Rpl B的乙酰化会降低其和r RNA的结合;另外我们发现Rpl B的乙酰化在氮源饥饿条件下会逐渐增强,而且核糖体蛋白质赖氨酸含量明显高于非核糖体蛋白质,这些都暗示了在氮源饥饿条件下,细菌可能通过调节Rpl B乃至整个核糖体的乙酰化来调控自身的生长。这些发现拓展了乙酰化影响蛋白质功能的研究,并为核糖体的研究开辟了新的天地。第二部分:MSMEG₄620的去乙酰化和自身ADP-核糖基化修饰的研究Sir2家族蛋白作为结构和功能都非常保守的蛋白质,参与了包括基因沉默、DNA损伤修复、生长代谢等几乎所有的生命活动;本部分我们通过NCBI Blast发现在耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc2155中除了存在SIRT2同源蛋白MSMEG₅175外,还存在一个SIRT4同源蛋白MSMEG₄620,我们分析了体内寄生和体外生长的分枝杆菌各个菌株中SIRT2和SIRT4同源蛋白的分布情况,发现前者只含有SIRT2同源蛋白,而后者则含有两个同源蛋白,暗示SIRT4同源蛋白跟营养以及初级代谢密切相关,因此本课题采用分子生物学手段并结合微生物学以及生物化学等方法对MSMEG₄620作了进一步的研究:1.我们通过加长同源臂的方法构建了MSMEG₄620敲除株,并比较了其和野生株在营养相对丰富或者贫瘠的培养基中的生长差异,结果发现,在营养相对丰富的培养基中,两者的生长没什么差异,而在贫瘠的培养基中,MSMEG₄620敲除株明显低于野生株,说明MSMEG₄620在体外生长的菌株mc2155中起着非常重要的作用。2.为了考察MSMEG₄620的去乙酰化活性,我们通过以化学底物测荧光的方法和通过胞质蛋白作Western blot检测等方法发现MSMEG₄620在体外具有较弱的去乙酰化活性,但MSMEG₄620敲除之后的胞质蛋白乙酰化明显增强,暗示了体内可能受到某些因子的激活,我们尝试在体外反应体系中加入各种脂肪酸,发现油酸可以对MSMEG₄620的去乙酰化活性进行激活。3.为了考察MSMEG₄620的ADP-核糖转移酶活性,我们在反应中添加biotinNAD+,并以avidin-HRP进行Western blot考察ADP-核糖转移酶活性;以组蛋白作为底物进行反应时,我们发现MSMEG₄620不能对组蛋白却能对自身进行ADP-核糖基化修饰,而且这种修饰不能被ADP-ribose抑制,反应体系通过HPLC也检测不到ADP-ribose的产生。然后,我们对保守的氨基酸进行了突变,发现ADP-核糖转移酶活性显著下降,说明了这些氨基酸对其活性至关重要;接着通过化学处理的方法,发现NH2OH可以将MSMEG₄620的ADP-核糖修饰基团去除,说明了修饰位点位于精氨酸上。另外,依据相关文献报道,在反应体系当中添加各种金属离子,发现Fe³⁺可以增强MSMEG₄620的ADP-核糖转移酶活性。4.我们比较了ADP-核糖修饰和未修饰的MSMEG₄620的去乙酰化活性,发现两者没有显著差异,说明了MSMEG₄620的ADP-核糖修饰不影响其去乙酰化活性。但是不管是哪种活性,MSMEG₄620都会消耗NAD+,因此我们比较了MSMEG₄620敲除株和野生株中的NAD+水平,发现前者总体而言高于后者。综上所述,我们首次发现MSMEG₄620具有脂肪酸激活的去乙酰化活性和Fe³⁺激活的自身ADP-核糖转移酶活性,两者共同调控了体内NAD+的水平,此外,我们发现MSMEG₄620在营养相对贫乏的培养基中发挥着重要的作用,敲除之后,细菌生长速度明显下降。这些发现为以后更好地研究MSMEG₄620乃至Sir2家族蛋白在原核生物中的生理功能奠定了基础。