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背景和目的:异位骨化(Heterotopic ossification,HO)是指在软组织内产生异常的骨组织。由严重的损伤、灼烧以及截肢手术之后引发的创伤性异位骨化较为常见,极大地降低了患者的生活质量。目前一般选用放射疗法和手术疗法等预防和治疗异位骨化,但一系列的副作用很大程度上限制了其应用。研究表明,异位骨化的形成与多种信号传导通路及生物活性调节因子相关,其中骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路的激活,对于异位骨化的产生至关重要。因此,我们可以通过靶向BMP信号通路,抑制其信号转导从而抑制异位骨化。如果能探究临床上现有的其他药物抑制BMP信号通路,势必能为预防与治疗对异位骨化带来捷径。本课题主要探究黄连素、阿司匹林对BMP信号通路成分和细胞成骨分化的的作用。通过构建小鼠异位骨化模型,探索黄连素、阿司匹林对异位骨化的影响。研究内容及方法:1研究黄连素、阿司匹林对BMP信号转导通路成分的影响1.1检测黄连素、阿司匹林对BMP信号转导通路中ALK2、Smad6和Smurf1表达的影响使用黄连素(0-100μM)、阿司匹林(0-10mM),以及二者联合用药处理小鼠来源的骨髓间充质干细胞C3H10T1/2、小鼠前成骨细胞MC3T3-E1。Western blot检测黄连素、阿司匹林对ALK2、Smad6和Smurf1蛋白表达水平的影响。1.2预先用黄连素、阿司匹林处理细胞24小时,然后加mBMP6刺激30分钟,Western blot检测黄连素对BMP6诱导Smad1/5磷酸化表达的改变。2观察黄连素、阿司匹林对MC3T3-E1、C3H10T1/2细胞成骨分化的影响2.1 MC3T3-E1、C3H10T1/2细胞加入诱导分化培养基向成骨细胞诱导分化,在培养的过程中加入黄连素、阿司匹林,或同时加入黄连素和阿司匹林,在培养的第7天和21天分别进行碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色,检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化程度,观察黄连素和阿司匹林对成骨分化的作用。3检测黄连素、阿司匹林对小鼠体内异位骨化的影响3.1采用跟腱切断/烧伤法构建小鼠异位骨化模型,同时用黄连素、阿司匹林干预。将8周龄的C57BL/6小鼠(雌性)跟腱切除,并在背部用60℃的砝码进行烧伤处理,术后每隔三天腹腔注射黄连素(10 mg/kg)、阿司匹林(10 mg/kg)。3.2术后8周,外观观察黄连素、阿司匹林对小鼠跟腱肿胀程度的影响。3.3术后8周取小鼠损伤后肢,micro-CT检测黄连素、阿司匹林对异位骨化的影响。结果:1在C3H10T1/2和MC3T3-E1细胞中,黄连素、阿司匹林呈浓度依赖性促进AMPK的激活;激活AMPK可抑制BMP6诱导的Smad1/5的磷酸化;在C3H10T1/2细胞中,激活AMPK会下调ALK2的表达,但不改变Smurf1、Smad6的表达;在MC3T3-E1细胞中,激活AMPK会下调ALK2的表达,上调Smurf1的表达,但不改变Smad6的表达。2在C3H10T1/2和MC3T3-E1细胞中,黄连素、阿司匹林均能够以浓度依赖性抑制碱性磷酸酶的活性和细胞矿化;黄连素和阿司匹林联合应用可以增强对细胞成骨分化的抑制作用。3在小鼠体内,跟腱切断/烧伤法可成功诱导异位骨化的产生;与异位骨化模型组小鼠相比,外观观察发现黄连素、阿司匹林干预组小鼠跟腱肿胀程度明显减轻;Micro-CT扫描发现,黄连素、阿司匹林干预组小鼠跟腱部位异位骨的形成明显减少。结论:黄连素、阿司匹林可以抑制BMP信号转导和细胞成骨分化,其抑制效应可能通过AMPK介导;黄连素、阿司匹林能够抑制异位骨化的进展。