慢性乙型病毒性肝炎作为感染性疾病与机体免疫应答具有密切的关系,特异性体液免疫反应通过分泌保护性抗体,以ADCC、中和作用等方式参与机体对乙肝病毒的清除,但其详细的机制缺乏深入研究。自发或经治疗获得HBeAg/HBsAg血清学转换被认为是乙肝病毒感染后机体免疫应答的重要标志,B淋巴细胞是抗体分泌过程的中心环节,在辅助性T淋巴细胞的促进作用下,不同亚型的B淋巴细胞可以增殖、分化形成为浆细胞,从而维持抗体的型别转换与分泌。因此研究T-B细胞相互作用的关系对了解机体抗HBV特异性体液免疫应答机制具有重要意义。第一章慢性乙型肝炎外周血Tfh细胞与B淋巴细胞表型及分布研究目的观察脾脏与外周血来源的Tfh细胞与B淋巴细胞表达差异;检测抗病毒治疗条件下,血清转换前后的慢性乙型肝炎患者外周血Tfh细胞与B淋巴细胞分布水平、以及相关功能分子表达的变化,为进一步研究Tfh细胞与B淋巴细胞相互作用在乙肝抗病毒治疗中的临床意义提供实验依据。方法1研究对象选择:未进行抗HBV-DNA病毒治疗的HBeAg+的慢性乙型肝炎患者、经抗病毒治疗后获得HB eAg血清学转换且HBV-DNA阴性的CHB患者、健康志愿者、乙肝肝硬化脾亢行脾切除术患者。2流式细胞仪检测:取各组研究对象外周血2 ml以及分离获得脾脏来源淋巴细胞悬液,以相应抗体标记,检测Tfh细胞与B淋巴细胞的细胞表型与百分率;3酶联免疫吸附试验检测:取各组研究对象外周血5 ml,分离制备血清,ELISA试剂盒检测外周血IL-21水平。4统计分析:采用spss17.0统计软件处理数据;采用Kolmogorov-Smirnov检验检测数据正态性,Levene检验检测方差齐性;采用配对资料的t检验,检测配对资料两组数据的差异;采用单因素方差分析或秩和检验检测各组数据差异性;采用Spearman检验或Pearson检验相关性分析检测外周血Tfh细胞与B细胞频数与表达分子等实验指标与慢性乙型肝患者病毒学以及生物化学等临床指标的相关性。结果1流式细胞仪鉴定不同来源的Tfh与B细胞表型分别以Tfh(CD4+CXCR5+)细胞与B(CD19+)淋巴细胞设门,检测脾脏与外周血来源的两类细胞膜表达分子水平:外周血来源的Tfh细胞膜上CCR7分子表达高于脾来源Tfh细胞膜上CCR7分子,差异具有统计学意义(P<0.05);IL-21R在两组Tfh细胞膜上表达无显著性差异;而PD-1、ICOS等分子在外周血来源的Tfh细胞膜则表达低于脾Tfh细胞,差异具有统计学意义(P<0.05);此外,CD38分子、IL-21R分子在外周血来源的B淋巴细胞上表达显著高于脾脏B细胞(P<0.05),CD27分子在两组B细胞表达无显著性差异,而PD-1分子则在在外周血来源的B淋巴细胞上表达较脾脏B细胞低,差异具有统计学意义(P<0.05);2流式细胞检测循环Tfh细胞分泌细胞因子PBMC经胞内染色,以Tfh(CD4+CXCR5+)细胞设门,流式细胞仪检测循环Tfh细胞分泌的细胞因子水平:循环Tfh细胞可分泌较高水平的IFN-γ(2.23±0.82),而分泌的IL-21(0.95±0.31)、IL-4(0.80±0.35)以及IL-17(0.93±0.48)水平较低;3.流式细胞仪检测循环Tfh细胞与B淋巴细胞表型与百分率变化采集三组研究对象外周血后,经流式抗体表面染色,流式细胞仪器检测外周血中Tfh、B细胞以及细胞相关表达分子的变化差异显示:健康志愿者外周血中的Tfh细胞(5.65±2.51),CCR7+Tfh(11.58±4.21)细胞以及浆细胞(1.36±0.55)细胞频数以及浆细胞上表达PD-1表达水平(4.38±2.05)显著低于CHB患者(P<0.05);尽管未抗病毒治疗者外周血Tfh(8.54±3.08)与CCR7+Tfh(14.43±5.91)低于抗病毒治疗者(9.78±3.14,14.75±5.05),而未抗病毒者(PD-1/PLA:8.56±3.50)外周血浆细胞上表达PD-1表达水平高于抗病毒治疗者(PD-1/PLA:7.82±4.34),但两组数据并无统计学差异(P<0.05),此外,浆细胞在治疗者显著低于治疗者(治疗者:5.23±1.21,治疗者:2.44±0.87);总B淋巴细胞频数与浆细胞上IL-21R表达水平在三组研究对象并无显著差异(健康:4.56±2.71,56.13±27.76;未治疗者: 3.88±1.68,52.21±22.75;治疗者:4.62±2.00,46.75±22.43);4 ELISA检测血清IL-21水平定量检测各组研究对象血清IL-21发现:与健康对照组(407.29±65.75)相比,CHB患者血清IL-21水平明显升高(P<0.05),但两组患者无显著性差异(未治疗者:536.60±109.44;抗病毒治疗者:488.69±105.76);5临床相关性分析将20慢性活动性乙型肝炎患者外周血实验室检测指标与临床检测(ALT,HBV-DNA等)指标进行相关性分析发现:循环Tfh细胞,浆细胞频数与肝功能指标以及病毒滴度不存在相关性,而浆细胞表达的IL-21R与PD-分子成负相关(P<0.01),同时还与病毒水平存在正相关(P<0.05)。结论1外周血来源与脾脏来源的Tfh细胞与B淋巴细胞表型不完全一致,外周血Tfh表达的CCR7+分子高,而PD-1,ICOS分子表达低,IL-21R在两者表达相近;此外,外周血B表达的CD38,IL-21R分子高,PD-1分子低,CD27表达相近,推测循环Tfh可能是Tfh细胞的一个子型;2外周血来源的Tfh细胞不仅仅分泌IL-21,还能分泌高水平的INF-γ,以及一定水平的IL-17与IL-4,可能介导细胞发挥一定的直接抗病毒作用;3在抗病毒治疗过程中,随着HB e抗原的消失与抗HB e抗原抗体的出现,Tfh细胞的在外周血的表达水平是增高的,且以CCR+Tfh细胞升高为主;总的B淋巴细胞表达水平不发生变化,但浆细胞水平是增高的,同时将细胞表达的PD-1分子水平在各组也有显著差异,推测慢性乙型肝炎患者外周血CCR7+Tfh细胞与浆细胞在机体的抗病毒免疫应答中发挥着重要的作用;4慢性乙型肝炎患者外周血血清IL-21水平高于健康志愿者,但血清学转换前后无差别,说明IL-21在乙型肝炎疾病的发生阶段发挥做重要作用,但其主要来源与具体作用仍需进一步研究;5临床相关性分析提示,ALT与浆细胞表达的IL-21R和PD-分子呈负相关(P<0.01),同时还与病毒水平存在正相关,推测浆细胞介导的体液免疫参与肝脏炎症的发生;第二章体外研究Tfh细胞与B淋巴细胞之间相互作用目的体外研究不同细胞因子刺激下Tfh细胞与B淋巴细胞之间的相互作用,为进一步研究T-B细胞交互作用在慢性乙肝病毒抗原血清转化中的意义提供实验依据。方法1研究对象选择:选择10例未进行抗HBV-DNA病毒治疗的HBeAg+的慢性乙型肝炎患者为研究对象。2标本制备与处理:磁珠分离外周血CXCR5+细胞,以空白、IL-4、IL-10、IL21四种处理因素刺激细胞,体外培养一周。3流式细胞仪检测:以相应抗体联合活细胞荧光染料CFSE记标细胞,检测B细胞百分率与荧光稀释度,反映B细胞增殖情况。4培养上清液检测:采用ELISA法检测培养上清液HB eAb滴度。5统计分析:采用spss17.0统计软件处理数据;采用Kolmogorov-Smirnov检验检测数据正态性,Levene检验检测方差齐性;采用单因素方差分析或秩和检验检测各组数据差异性。结果1流式细胞鉴定CXCR5+细胞纯度与百分比磁珠分离后CXCR细胞纯度为68.82%±12.23%,其中CD4细胞占55.25%±17.82%,CD19细胞占36.98%±8.25%;2 CFSE标记细胞观察B淋巴细胞增值体外培养慢性乙型肝炎患者来源的CXCR5+细胞7天,流式细胞仪检测B细胞组成:培养前B细胞百分率为32.21%±6.82%,经不同细胞因子刺激培养7天后,空白对照组为:37.71%±8.21%,IL-4刺激组为:48.22%±9.17%;IL-10刺激组为:40.21%±6.62%;IL-21刺激组为54.35±6.38%;经方差分析后显示;与培养前比较,培养7天后各组细胞均出现明显增值(P<0.05);而较未刺激组相比,IL-4与IL-21刺激组B细胞增值最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05);3 ELISA检测培养上清液HB e Ab定量不同细胞因子刺激培养一周后,采用ELISA法检测培养上清液中HB e Ab水平,其中IL-21刺激组产生水平明显高于其它组,差别具有统计学意义(P<0.01),平均浓度为0.729±0.132 pg/ml,空白对照组,IL-4刺激组与IL-10刺激组分别为0.429±0.128 pg/ml,0.415±0.114 pg/ml,0.468±0.135 pg/ml;三组分别的抗体量无明显差别,数据无统计学意义(P>0.05);结论1磁珠分离可以分离获得较高纯度的CXCR5+细胞,CXCR5细胞主要由B细胞,Tfh细胞组成,还包括少量的其它细胞,如DC,CD8+T淋巴细胞等;2在Tfh细胞提供的CD40L,ICOS等信号背景下,IL-21与IL-4可显著刺激B淋巴细胞增殖,其作用强于IL-10,有利于提高机体体液免疫应答;3 IL-4,IL-10,IL-21三种细胞因子促进慢性乙型肝炎患者来源B淋巴分泌HB e Ab,以IL-21作用最强,而IL-10次之,提示IL-4侧重于促进B淋巴增殖,而IL-10侧重于促进B细胞分泌抗体,而IL-21在两个环节作用均强,有利于促进慢性乙型肝炎患者的血清学转换;