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研究背景和目的缺血再灌注(Ischemia and reperfusion,I/R)损伤是组织缺血后血流恢复时导致的一种典型的病理损伤,临床上常见于肝移植、脑卒中等严重危害人体健康的疾病。缺血性损伤是缺乏血供所导致的组织损伤,如冠状动脉梗塞导致的心肌缺血性损伤等。目前临床上针对I/R和缺血损伤都没有理想的治疗手段,研究I/R和缺血损伤寻找治疗方法仍然十分必要。氧化损伤、炎症水平增高、细胞死亡是I/R和缺血损伤主要的病理生理学基础,围绕这些机制研究寻找治疗手段是许多研究的主要思路。虽然诸多动物研究中证实,针对致病机制进行的治疗,对再灌注损伤和缺血损伤有较好的疗效,但并未能进一步应用于临床。甲烷的生物活性一直未被认识清楚,近年来有研究表明,生物机体正常情况下可以利用甲烷合成有机物,同时损伤的组织细胞自身也会合成甲烷,更有研究发现呼吸甲烷可治疗小肠I/R损伤。但是考虑到,甲烷治疗小肠缺血再灌注损伤的工作仍然不够全面,甲烷治疗I/R损伤作用尚需要进一步明确,甲烷对其他重要器官I/R损伤和缺血性损伤是否具有保护效应也需要研究,甲烷治疗I/R和缺血性损伤的机制也需要深入探讨。因此,本研究分别探索甲烷对肝脏、脑组织I/R损伤和心脏缺血损伤的保护效应并初步探讨分子机制。首先用肝I/R损伤模型确定甲烷对肝I/R损伤的保护效应,寻找甲烷治疗的合适剂量与给药时间,从抗炎症、抗氧化和抗细胞凋亡等方面进一步确认甲烷保护作用途径,对这些作用机制进行初步探讨;在上述研究基础上,利用脑缺血再灌注损伤模型,进一步确定甲烷对中枢神经损伤的保护作用,并从细胞凋亡角度进行了机制的初步探讨;利用心脏缺血损伤模型确认甲烷对缺血性损伤的治疗作用,进一步确认甲烷最佳给药浓度、时间以及与组织含量之间的关系,探索甲烷是否通过减少氧化炎症水平,抑制细胞凋亡保护心肌缺血性损伤。本研究主要分三个部分:第一部分甲烷治疗肝I/R损伤及其机制研究方法:建立肝i/r损伤模型,缺血60mins,再灌注6h后检测,观察五个浓度对肝脏i/r损伤后肝功能指标的治疗效果,找出甲烷生理盐水给药的最佳剂量。甲烷生理盐水于灌注开始时立即一次性给予实验设计的剂量。然后将第二批动物随机分为三组:假手术组,i/r损伤组以及i/r后给予10ml/kg甲烷生理盐水治疗组。检测肝功能指标,炎症指标白介素-1β(il-1β),白介素6(il-6)与肿瘤坏死因子-α(tnf-α),检测氧化指标8-羟基鸟嘌呤(8-ohg),超氧化物岐化酶(sod),丙二醛(mda),检测细胞凋亡指标caspase-3,观察组织切片he染色,tunel阳性细胞染色。结果:剂量为10ml/kg的甲烷生理盐水给予后,明显降低炎症水平,减弱氧化损伤,抑制细胞凋亡的发生,与i/r损伤模型组比较具有明显统计学差异。结论:甲烷生理盐水是一种可行的给药方法,腹腔注射10ml/kg剂量可以获得比较理想的效果,甲烷可通过减少炎症,氧化损伤与抑制凋亡等途径发挥治疗肝脏i/r损伤的作用。第二部分甲烷治疗脑I/R损伤及其机制研究方法:建立脑I/R损伤模型,将实验动物随机分为三组:假手术组,脑i/r损伤给予生理盐水组,脑i/r损伤给予甲烷生理盐水组。甲烷生理盐水给予剂量为10ml/kg,于再灌注开始后立即一次性给予。观察脑梗死体积,行为学评分,脑组织切片he染色,tunel阳性细胞染色,westernblot检测caspase-3表达。结果:甲烷给药有效改善动物脑i/r损伤后行为学评分,减少脑梗死体积,减小he染色脑组织死亡面积,减少tunel阳性细胞数目,减少caspase-3蛋白表达量。结论:甲烷通过抑制神经元细胞凋亡对i/r后脑损伤发挥治疗作用。第三部分甲烷治疗心肌缺血损伤及其机制研究方法:建立心肌缺血模型,第一批动物采用多种剂量研究量效曲线。第二批实验动物随机分为三组,假手术组,心肌缺血损伤给予生理盐水模型组,心肌缺血损伤后给予甲烷生理盐水治疗组,甲烷生理盐水按照实验设计的剂量在左前降支结扎30 mins后一次性给予,检测给予甲烷生理盐水后,血液与心肌组织中甲烷含量。检测心肌梗死体积,检测心室重构指标与射血分数。检测氧化指标SOD,MDA,8-OHG,CD68与MPO,检测炎症指标IL-1β,IL-6,TNF-α以及黄嘌呤氧化酶,检测凋亡指标caspase-3,活化的caspase-3,caspase-9,活化的caspase-9的蛋白表达,检测Bax,Bcl-2蛋白表达及其比值结果,检测细胞内细胞色素C,线粒体内细胞色素C及其比值,检测Bax,Bcl-2,caspase-3的免疫组化阳性数目。结果:甲烷生理盐水含甲烷浓度稳定,给予甲烷生理盐水后组织中甲烷含量增高。与模型组相比,给予10 ml/kg甲烷生理盐水后显著减小心肌梗死体积,减缓心室重构进程,降低炎症水平,减弱氧化损伤,抑制caspase-3,caspase-9以及Bax/Bcl-2比值,抑制细胞色素C的活化与增多。结论:甲烷生理盐水可治疗心肌缺血损伤,其机制可能是通过减少氧化炎症水平,抑制细胞凋亡产生的。总结:本课题系列研究通过使用多种模型,提供了大量证据,证明甲烷生理盐水具有治疗肝脏、脑I/R损伤和心肌缺血损伤的作用。甲烷生理盐水治疗可以改善肝I/R损伤后肝功能;治疗脑I/R损伤,保护脑组织,改善脑功能;改善心肌缺血损伤后心功能并预防心室重构。甲烷生理盐水的器官保护作用可能与其抗炎症反应,抗氧化损伤与抑制细胞凋亡特性有关。本课题创新性将富含甲烷生理盐水应用于研究,已获批发明专利,被其他学者采纳并用于研究,本课题也为临床缺血性疾病的治疗应用提供理论依据。