NF-κB蛋白是一类能特异性地识别结合DNA的Rel类蛋白质二聚体转录因子。NF-κB蛋白通过调控众多靶基因的转录表达而在免疫、炎症反应、细胞增殖与凋亡以及肿瘤发生等许多生理过程中发挥重要作用。NF-κB及调控活性的转导通路已经成为相关药物研发以及疾病诊断的一个靶标。对NF-κB蛋白传统的检测方法电泳迁移分析（EMSA）已经不能满足现代生命科学和现代医学在快速、高通量检测和分析方面的需求。构建新型NF-κB蛋白的简便、快速、高通量检测技术和方法将会推动人们对NF-κB蛋白及其与之相关的疾病、药物等更深入地认识，以及推进生命科学和现代医学的研究进程。现代生物技术以及生物分子固定化技术的发展，为分析具有特殊意义的生物分子提供了有力的支撑。本文首先以包被有琥珀酰亚氨酯的96孔微孔板为基底，通过有氨基修饰的DNA与琥珀酰亚氨酯特异性反应，在微孔表面固定单链DNA分子，再通过互补链杂交制备了双链DNA包被的96孔微孔板。优化了这一系统的重要参数，取得了明显的效果。研究了不同固定方法DNA固定效率，比较了三种标记方法对转录因子NF-κB的检测效果。选择了已知疗效的天然活性成分以及药物对ECV304细胞作用，诱导后，用构建的双链DNA包被微孔板以及化学发光EMSA方法对NF-κB进行了检测。结果表明，这种方法的分析结果和EMSA方法是一致的。在此基础上，对两种新药进行了初步筛选。这一技术将为研究与DNA结合蛋白相关的研究领域提供有力的平台。纳米颗粒组装技术在生物检测中的应用是近年来发展起来的新技术。由于纳米颗粒自组装的可控性、简便性，所以这一技术倍受关注。本文应用提拉成膜技术将PMMA纳米颗粒自组装成蛋白石薄膜，在PMMA纳米颗粒的空隙中灌入纳米TiO₂，经过煅烧后构建了TiO₂反蛋白石薄膜生物传感器。通过光纤光谱仪、扫描电镜以及X射线光电子能谱对构建的TiO₂反蛋白石薄膜进行表征，并在有机溶剂、免疫学和NF-κB检测中进行了应用。该方法为构建非标记生物传感器提供了新途径。本文所获得的主要研究结果如下：1、双链DNA分子包被的96孔微孔板检测转录因子NF-κB蛋白系统的构建通过包被有琥珀酰亚胺酯功能基团的96孔微孔板固定氨基修饰的单链DNA分子，再通过DNA互补链杂交构建了双链DNA包被的96孔微孔板。包被不同浓度双链DNA探针对测定NF-κBp50的信号有影响，在双链DNA探针浓度为75pmol／100μL-well包被时，10ng NF-κBp50会与双链DNA探针结合达到饱和值。双链DNA包被的96孔微孔板检测在NF-κBp50浓度为4-70 ng／50μL-well范围内，存在很好的线性检测范围，R²＞0.99。双链DNA包被的微孔板不但可以定量检测标准的NF-κB，而且，可以定量检测由细胞核提取的核蛋白。最低检测浓度可以达到0.625μgTNF-α诱导的细胞核提取核蛋白，1.25μg非诱导的细胞核提取核蛋白以及4ng标准的NF-κB。通过EMSA和微孔板竞争反应方法分别检测了标准的NF-κBp50蛋白和提取的核蛋白与靶DNA序列的结合特异性。特异性分析表明，这种方法构建的双链DNA包被的96孔微孔板有很好的特异性，可以用来研究DNA结合蛋白的特异性结合位点。这种双链DNA微孔板榆测NF-κB具有很好的重现性，可以作为NF-κB高通量检测分析。2、对建立的微孔板检测系统的各个参数进行优化优化后的工作参数为：固定DNA探针的浓度为25 pmol／well，单链DNA固定后用3％BSA封闭一次，杂交后再用3％BSA封闭一次，NF-κB蛋白与DNA探针结合时间为90 min，一抗、二抗的浓度为1：1000稀释，一抗孵育时间为90 min，整个检测过程在25℃下进行，显色时间为30 min。检测条件优化后，检测NF-κBp50蛋白的信号比优化前提高了近三倍。核提取蛋白不需要添加非特异性探针来避免杂蛋白的干扰。3、三种标记方法检测NF-κB系统的比较及在药物筛选中的初步应用NOS包被的双链DNA微孔板和链霉亲和素包被的双链DNA微孔板相比，前者固定的DNA分子少于后者，但是前者比后者更稳定，便宜。在检测范围上，前者的检测线性范围小于后者。两种双链DNA微孔板的最低检测限均低于化学发光EMSA一个数量级。两种双链DNA微孔板检测已知药理学作用的两种天然抗氧化剂-姜黄色素和去甲二氢愈创木酸在细胞外直接抑制NF-κBp50的结果一致，药物抑制浓度与趋势和文献报导的一致。构建的双链DNA微孔扳在两种新药鲁斯可皂苷元和薯蓣皂苷元开发中的应用表明，两种新药均对ECV304细胞核蛋白的表达具有明显地抑制作用，和化学发光EMSA检测的结果一致。两种方法对已知疗效的药物-地塞米松研究也是一致的。这些结果揭示，构建的双链DNA微孔板可以在与NF-κB相关的新药开发中应用。这种方法与传统的NF-κB分析方法EMSA方法相比，有以下优点：1)快速：样品处理后3-5h即可完成；2)简单：只需会操作ELISA就可以；3)灵敏度高：4ngNF-κB／孔，低于EMSA一个数量绒；4)可以定量：线性范围在4-70 ngNF-κB，R²=0.997；5)高通量：一次可以检测96或者386个样品，6)安全性好：无须放射性标记。4、纳米颗粒自组装与新型非标记生物传感器的建立选择了三种不同的纳米微球颗粒，通过提拉自组装方法制备了不同堆积方式的蛋白石光子晶体薄膜。优化了成膜的参数。讨论了自组装不同堆积方式的原理。制备了三维大孔径TiO₂反蛋白石光子晶体薄膜传感器。研究表明：软纳米微球可以堆积成FCC（111）和FCC（100）两种晶体结构共同存在的形式。在优化自组装条件后FCC（100）型组装面积可以达到200μm×200μm。自组装堆积形式与纳米微球的材料有紧密的关系。软纳米微球自组装机理遵循接触面积最小的原理，也是最大熵值驱使自组装的结果。在紧密堆积FCC（111）的296nmPMMA光子晶体模板中灌入二氧化钛纳米颗粒，在严格控制煅烧条件去除膜板后，制得了表面平整，结构均一的TiO₂反蛋白石光子晶体薄膜。通过薄膜的反射光谱、SEM和XPS对制备的TiO₂反蛋白石光子晶体薄膜进行了表征。结果进一步表明通过这种方法成功地构建了三维大孔径TiO₂反蛋白石光子晶体薄膜传感器。5、三维大孔径TiO₂反蛋白石光子晶体薄膜传感器的应用研究以制备的TiO₂反蛋白石光子晶体薄膜为传感基底建立了光反射光谱仪传感器。在不同折射率有机溶剂中和同一折射率有机溶剂中进行了检测，并与聚苯乙烯反蛋白石薄膜、SiO₂反蛋白石薄膜进行了对比。进一步在免疫生物传感器进行了应用研究。研究发现：这种TiO₂微孔洞薄膜可以作为不同折射率有机溶液的传感器，可以定性和定量检测不同折射率有机溶液，分辨率达到0.007。和相同孔径的SiO₂、聚苯乙烯反蛋白石薄膜相比，这种TiO₂微孔洞薄膜有较高的灵敏度，而且可以重复利用等特点。这种材料有很好的生物相容性，能够应用在非标记免疫生物传感器中，检测线在150 pgmm^-2到3.0ng mm^-2，检测灵敏度为450 nm／RIU，有很好的特异性。通过对TiO₂微孔洞薄膜的硅烷化偶联及戊二醛反应后，可以将DNA分子成功的固定在TiO₂微孔洞内表面。对NF-κB分析表明，这种非标记检测体系可以检测到20nM，具有很好的特异性。可以作为初步研究DNA与DNA结合蛋白相互作用的平台。