背景食管癌是我国最为常见的消化道恶性肿瘤之一。世界卫生组织最新的恶性肿瘤流行病学报告显示,我国食管癌的发病及死亡人数均超出世界一半以上；每年中国大陆食管癌新发病例28.7万例,发病率为21.88/10万,居各类恶性肿瘤第5位；死亡20.8万例,死亡率为15.85/10万,居第4位。我国食管癌发病的组织类型与西方国家明显不同,95%以上为食管鳞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC),而西方国家则腺癌多发。我国人口基数大,加之食管癌发病率高,为更好地研究食管鳞癌提供了优势资源。尽管近年来治疗技术不断进步,但因食管癌恶性程度高、发展快、复发率高等特点,加之手术切除难度大、药物治疗效果欠佳等因素,食管癌患者的5年生存率仍不超过14%。改善预后是目前食管癌治疗亟待解决的问题,而寻找特异性与敏感性较高的预后指标,并以其为指导开展和实施个体化治疗,使每位患者最大程度的治疗获益,这也是目前食管癌治疗的最终目标。激活的蛋白激酶C受体1 (receptor for activated C kinase 1, RACK1)分子是一种锚定蛋白,含有7个WD-40结构域,RACK1分子通过该结构域和其他的分子结合,共同形成复合物,进而发挥各种病理及生理功能。人RACK1基因是高度保守的,含有8个外显子和7个内含子,位于人的5号染色体上(5q35.3),因RACK1的七个p螺旋组成的空间结构可以提供多种蛋白结合位点,故可为多种蛋白之间的相互作用提供作用表面。RACK1既可以作为PKC的锚定蛋白,还可以招募其它蛋白,发挥支架蛋白的作用。RACK1可以与多种信号分子结合,在信号转导通路中发挥重要的作用,并可参与肿瘤的发生发展,与肿瘤的关系十分密切,研究发现RACK1在人恶性肿瘤中可表达上调,例如非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、口腔鳞癌等,并且其表达水平与肿瘤分期和淋巴结转移等情况相关。不仅如此,RACK1还被证实可以预测多种恶性肿瘤的预后,如乳腺癌、肝癌、口腔鳞癌等。但是作为中国发病率较高的食管鳞癌,RACK1与此种恶性肿瘤的预后关系目前研究甚少。目的1.研究RACK1蛋白在人食管鳞癌组织中的表达情况；2.探讨食管鳞癌患者中RACK1蛋白的表达与患者长期预后的关系。方法1.研究对象收集自2007年1月至2007年12月来我院胸外科行食管癌手术的患者,2007年在我院有238例患者行食管癌手术,术前无任何辅助治疗的患者纳入本次研究。所有入组病例必须有明确病理诊断为食管鳞癌,且有胸部及腹部CT结果。病例收集时须详细记录患者的性别、年龄、肿瘤发病部位、病变长度、肿瘤最大直径、TNM分期、分化程度、治疗方案等,并加以分析。排除标准：病理类型为非鳞癌；缺乏病理诊断结果；术前曾行辅助治疗；术后30天内死亡；不配合以致难以获得完整病例资料。最终有100例患者纳入本研究,其中男性患者79例,女性患者21例,年龄中位数为60岁。2.数据随访采用电话随访的形式,自我院病案室收集患者病历资料时记录患者联系方式,对入组患者进行随访。随访截止时间为2013年1月31日。3.标本采集根据住院号及病理号自我院病理科查询入组患者的手术石蜡标本,选择手术切除的肿瘤部位行病理切片,同时选取肿瘤周围组织行病理切片,用作对照。切片厚度约为5μm。4.免疫组织化学染色及结果判断按照方法3中操作获得病理切片后,我们对其进行免疫组织化学染色,选择5个具有代表性的高倍视野(10×40倍),计数IHC标记定位准确的阳性细胞占肿瘤细胞的比例并记分。细胞数占肿瘤细胞数的0%记为0分,1%-24%记为1分,25%-49%记为2分,50%-74%记为3分,75%以上记为4分；染色强度以无着色、弱、中、强分类,依次记为0,1,2,3分；最后计算两种记分的乘积,所得结果可为：0、1、2、3、4、6、8、9、12,将0-4列为RACK1阴性表达组,6-12列为RACK1阳性表达组。结果1.RACK1蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况RACK1蛋白在人体食管鳞癌组织中的主要着色部位在细胞浆,偶见细胞核着色。根据RACK1表达情况将患者分为阳性表达和阴性表达两组,100例患者中RACKl蛋白阳性表达者有59例,阴性表达者有41例。阳性表达组患者中男性占47例,女性占12例,阴性表达组患者中男性占32例,女性占9例,男性发病率较高,符合食管癌发病特点,但是并未达到统计学意义的水平(P=0.846)。阳性表达组患者平均年龄为61.9岁,阴性表达组患者平均年龄为60.4岁,两组患者年龄无统计学差异,P=0.416。另外两组患者的发病部位、N分期、淋巴结转移比率是否大于0.2、TNM分期、组织学分化程度、治疗方案也无明显统计学差异。对比两组患者,我们发现患者的肿瘤长度(P=0.012)、肿瘤直径小于3cm的比例(P=0.047)、T分期(P=0.032)、淋巴结转移(P=0.038)差异达到统计学意义水平。2.RACK1蛋白组织表达与食管鳞癌患者预后的关系Kaplan-Meier生存分析结果显示RACK1阳性表达患者的总体生存率为27.1%,而RACK1阴性表达患者为56.1%,log-rank检验分析发现总体生存率差异有明显统计学意义,P=0.002。在无进展生存率方面,R.ACK1阳性表达组也显著低于阴性表达组,差异达到统计学水平,P=0.001。对影响患者总体生存率和无进展生存率的各因素进行单因素分析后将RACK1表达、T分期、N分期、淋巴结阳性、阳性淋巴结比率以及TNM分期(P值均小于0.05)纳入进行多因素分析。多因素分析后发现,RACK1表达(RACK1阴性：HR 0.532,95%CI0.301-0.942,P=0.030)是影响患者总体生存率的独立预后因素。在患者无进展生存率方面上,RACK1表达(RACK1阴性：HR 0.523,95%CI0.294-0.929,P=0.027)是患者的独立预后因素。结论1. RACK1在食管鳞癌组织中存在差异表达；2. RACK1阳性表达患者总体生存率和无进展生存率均低于阴性表达患者,RACK1高表达患者预后差。背景食管癌预后较差的原因有很多,除了筛查诊断手段的不完善和治疗失败,进展较快也是一个很重要的因素,而高侵袭性和高转移倾向的生物学行为特点则是食管癌病程进展的根本原因。因此,我们迫切需要深入理解食管癌的侵袭和转移机制,寻找治疗新靶点。鉴于我国食管癌发病的病理类型中鳞癌发生率较高,我们以食管鳞癌为对象展开研究。RACK1作为衔接蛋白,可以招募各种信号通路有关的因子或蛋白,参与信号通路的调节,进而调整细胞周期或者细胞凋亡等,最终实现其对肿瘤进展的调控。研究发现RACK1通过调节PI3K/Akt信号通路的活性进而促进乳腺癌细胞增殖,还通过与RhoA的相互作用继而活化RhoA/Rh。激酶通路,促进乳腺癌细胞迁移,此外RACK1能够调节细胞中Ki-Ras介导的信号通路,并能影响细胞形态。然而由于RACK1可以与多种蛋白分子结合,其对肿瘤细胞增殖、迁移能力等的影响并不一致,RACK1可以抑制细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)的磷酸化,延缓细胞周期进程,发挥抑制结肠癌细胞生长的作用。我们前期研究发现RACK1表达与人体食管鳞癌的肿瘤直径是否小于3cm、肿瘤长度、T分期、淋巴结转移有关,根据我们的前期研究成果及现有的报道,我们推测RACK1与食管鳞癌进展有关,RACK1的表达水平可以影响食管癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。目的1.构建RACK1基因稳定敲减的食管癌细胞系；2.检测RACK1基因敲减后食管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的改变；3.检测PKC激活剂或抑制剂预处理后食管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的改变。方法1.细胞培养用添加了10%胎牛血清的高糖型DMEM培养Eca109及EC9706细胞株,置于37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养。2.shRNA转染及稳筛根据RACK1的基因序列,委托上海吉玛生物有限公司设计合成shRNA及其干扰表达载体pGPU6/GFP/Neo。根据Invitrogen公司的转染试剂LipofectamineTM2000的操作说明书进行细胞转染。用G418对转染后的食管鳞癌Eca109和EC9706细胞进行筛选。建立RACK1稳定敲减的细胞系。3.细胞接受药物预处理细胞处于对数生长时,用完全培养基配置佛波酯PMA/TPA,调整浓度至100nM,并以此更换细胞培养基,培养20小时后更换为新鲜完全培养基。同样方法加入星孢菌素staurosporine(SP)。4.细胞总蛋白提取及Western Blot用RIPA裂解液处理细胞并将产物经14000rpm4℃离心10min,收集上清液获得总蛋白。应用BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液并煮沸使蛋白变性,凝胶电泳分离,将分离所得蛋白条带通过转移电泳转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭2小时,依次加一抗二抗孵育。次日用ECL化学发光法对蛋白条带进行检测。5。克隆实验用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期细胞制成细胞悬液,将细胞悬液作梯度倍数稀释,计数、接种,常规培养2-3周,出现肉眼可见的克隆时终止培养。用0.1%的结晶紫溶液室温染色1小时、显微镜下计数。6.裸鼠移植瘤模型及移植瘤伊红-苏木素(HE)染色取处于对数生长的细胞,制备细胞悬液,调整细胞密度为1×107个/ml。用1ml注射器抽吸0.2m1细胞悬液注入裸鼠后背部,每五天测量肿瘤的长径a和短径b,肿瘤体积计算公式为Vmm3=a×b2×05。根据肿瘤体积绘制肿瘤的生长曲线。4周后处死老鼠,小心剥离肿块,游标卡尺测量肿瘤体积。将移植瘤标本制成病理切片,进行HE染色。7. Transwell迁移、侵袭实验用无血清培养基制备细胞悬液,取细胞悬液200μl加入Transwell小室,下室加入500μl含胎牛血清的培养基,培养24小时后,用棉签擦去上室内的细胞并计数。侵袭实验需要首先包被基底膜,其他步骤同迁移实验。结果1.食管癌细胞中RACK1的表达及RACK1敲减的验证Western Blot验证了RACK1在人食管癌细胞系Eca109和EC9706中均表达,RT-PCR发现shRNA转染后RACK1mRNA表达量降低,Western Blot进一步验证了转染后两种细胞中RACK1蛋白水平的降低,2.RACK1基因敲减后食管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力变化的检测体内及体外实验证实RACK1基因敲减后,Eca109和EC9706增殖能力降低。克隆形成实验结果显示,与对照组相比,实验组克隆形成数明显降低(Eca109P=0.0044；EC9706 P=0.0008)。裸鼠移植瘤模型进一步证明了此结果,fRACK1稳定敲减后的细胞所形成的移植瘤的瘤重(Eca109 P=0.0003; EC9706P=0.0029)、瘤体积(Eca109 P=0.0119；EC9706 P=0.0192)均显著低于对照组。Transwell实验证实RACK1基因敲减后Eca109和EC9706迁移、侵袭能力降低。RACK1敲减后的Ecal09细胞和EC9706细胞迁移细胞数均显著小于对照组(Eca109 P=0.0108,EC9706 P=0.0037)。RACKl敲减后的Eca1 09细胞和EC9706细胞侵袭细胞数均显著小于对照组(Eca109 P=0.0014, EC9706 P=0.0133)。3.PKC激活剂PMA/TPA、PKC抑制剂staurosporine (SP)分别预处理食管癌细胞后其增殖、迁移、侵袭能力变化的检测PMA预处理后的Eca109和EC9706的细胞克隆数显著高于未行预处理的细胞,(Eca109 P=0.0012; EC9706 P=0.0015),SP预处理组则显著低于对照组(Eca109 P=0.0016; EC9706 P=0.0059)。裸鼠移植瘤实验中,PMA预处理后的Eca109和EC9706细胞形成的移植瘤瘤重、瘤体积均显著高于对照组(瘤重：两组细胞P-0.0001；瘤体积：Eca109 P=0.0288, EC9706 P=0.0405), SP预处理组则显著低于对照组(瘤重：Eca109 P=0.0001, EC9706 P=0.0002;瘤体积：Eca109P=0.0308, EC9706 P=0.0103)。PMA预处理组Eca109和EC9706的迁移细胞数显著高于对照组(Eca109P=0.0040; EC9706 P=0,0015), SP预处理组则显著低于对照组(Eca109 P=0.0012;EC9706 P=0.0006)。 PMA预处理组Eca109和EC9706的侵袭细胞数显著高于对照组(Eca109 P=0.0448; EC9706 P=0.0138), SP预处理组则显著低于对照组(Eca109 P=0.0049; EC9706 P=0.0007)。结论1.RACK1敲减后食管癌细胞Eca109和EC9706的增殖能力降低,所形成的裸鼠移植瘤的重量及体积降低,细胞的迁移、侵袭能力降低。2.PKC激活剂PMA/TPA预处理食管癌细胞Eca109和EC9706后,细胞的增殖能力升高,裸鼠成瘤能力升高,细胞迁移、侵袭能力升高,而SP预处理细胞后则均降低。背景食管癌的侵袭转移是一个连续过程,涉及肿瘤细胞粘附性下降、基质降解、肿瘤细胞迁移和新生血管形成等多个环节。研究表明,癌细胞主要通过上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)获得迁移、侵袭能力,进而突破基底膜发生侵袭转移。EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象,癌细胞经历EMT后粘附性下降或消失,细胞运动能力增强,从而获得突破基底膜、侵袭周围组织的能力,进入淋巴或血管到达远处脏器,通过问质上皮转化(mesenchymal epithelial transition, MET)形成新的肿瘤即转移瘤。体内、体外实验证明了癌细胞发生侵袭转移前有EMT的发生。这些都提示,EMT是肿瘤早期转移启动过程中的重要组成部分,阻断EMT的发生可能抑制肿瘤早期转移。RACK1的多蛋白结合表面赋予了其功能多样化的生物学特性,RACK1可以与多种因子结合,进而调节肿瘤细胞的运动迁移能力、侵袭能力、增殖及抗凋亡能力等,发挥其调节肿瘤进展的作用。在第二部分的研究中,我们发现,RACK1可以促进食管鳞癌增殖、侵袭和迁移,进而促进肿瘤进展。而EMT作为肿瘤侵袭转移的重要途径,是否参与了RACK1促进食管鳞癌进展的过程,目前研究甚少。已有报道证实,人乳腺癌细胞中高表达RACK1可以引起EMT过程中间质标志物(Vimentinα-SMA)表达的上调及上皮标志物(E-Cadherin和CK-19)表达的下调。结合前期结果和已有的报道,我们推测EMT可能参与了RACK1促进肿瘤进展的过程。目的探讨RACK1促进食管鳞癌进展是否与EMT有关。方法1-细胞总蛋白提取及Western Blot方法同前。2.免疫组织化学染色及结果判断方法同前。结果1.食管癌细胞中E-cadherin 和 Vimentin的表达与RACK1表达的相关性与对照组相比较,RACK1敲减后Eca109和EC9706细胞E-cadherin表达水平升高,Vimentin表达水平降低。2.食管鳞癌组织E-cadherin和Vimentin的表达与RACK1表达的相关性患者食管鳞癌组织中E-cadherin表达与RACK1的表达呈负相关,Vimentin表达与RACK1的表达呈正相关。结论食管鳞癌细胞及组织中RACK1表达与EMT标志物E-cadherin 和 Vimentin表达有关,与E-cadherin表达呈负相关,与Vimentin表达呈正相关,RACK1促进食管鳞癌进展与EMT相关。