家禽卵巢是研究卵巢生物学和卵泡发育的理想模型,而卵泡颗粒细胞因其独特的结构特点及其在卵泡发育中的重要作用,常被看作卵泡发育的一个重要标志。本实验通过小黄卵泡颗粒细胞体外培养模型,探讨了家禽生产中重要的生殖激素、生长因子及与卵泡发育相关的营养物质对颗粒细胞生长发育和功能的影响及作用机理,以期为家禽优势卵泡选择及繁殖性能的提高提供理论依据。1.等级前小黄卵泡颗粒细胞体外培养模型的建立和应用采用机械法和胶原酶法分散成年产蛋鸡等级前小黄卵泡颗粒层,添加不同浓度的血清培养颗粒细胞。细胞培养结束后用四甲偶氮唑蓝比色法测定其活性。结果表明在添加0.5%胎牛血清(FCS)的培养液中预培养16h后换成无血清培养液继续进行培养,同时用药物处理细胞,这一培养模型能较好地维持颗粒细胞的存活和增殖。此外,本实验中选用对卵泡发育起重要调节作用的卵泡刺激素(FSH)验证培养模型的可行性。0.1～10 ng/ml的FSH对颗粒细胞的增殖作用呈显著的剂量-效应关系。FSH对小黄卵泡颗粒细胞促增殖作用的信号转导途径的研究表明：通过添加PKA.PKC信号途径激活剂(forskolin.PMA)及其相应的抑制剂(H89、H7),发现PKA信号转导系统在FSH的促小黄卵泡颗粒细胞增殖过程中起主导作用。细胞核增殖抗原(PCNA)免疫细胞化学测定结果与上述结果呈相同趋势。以上结果表明所建立的鸡小黄卵泡颗粒细胞培养模型是一种评价外源性激素离体生物效应的简易、快速和准确并且易于观察的良好模型。2.前列腺素对颗粒细胞的促增殖作用及其机理研究本实验探讨了前列腺素PGE,对鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞增殖的作用及其作用途径。颗粒细胞在低浓度血清(0.5% FCS)中预培养16h后换成无血清培养液继续进行培养,同时单独添加前列腺素PGE1(0.1～100 ng/ml)或FSH(10 ng/ml)处理24h。当PGE,浓度在0.1～10 ng／ml范围时,颗粒细胞的增殖作用呈上升趋势,当浓度达到100ng/ml时,其作用呈下降趋势,其中PGE1 10 ng/ml的作用效果最明显,且其作用效果类似与FSH。PG作用机理研究发现,当前列腺素受体阻断剂SC19220(10-7～10-5mol/l)分别与FSH和PGE1联合处理后,FSH和PGE1的促增值作用均被显著抑制,且呈剂量效应；前列腺素合成酶阻断剂消炎痛(10-7～10-6 mol/l)与FSH联合后,FSH对颗粒细胞的促增殖作用也呈剂量效应被抑制。PGE,对小黄卵泡颗粒细胞促增殖作用的信号转导途径的研究表明：通过添加PKA、PKC信号途径激活剂(forskolin、PMA)及其相应的抑制剂(H89、H,),发现PKA信号转导系统在PGE。的促小黄卵泡颗粒细胞增殖过程中起作用。PCNA测定结果与上述结果呈相同趋势。转录因子CREB1免疫细胞化学实验发现,PGE,可以促进颗粒细胞内CREB1的表达,但其表达强度较forskol in处理组弱。上述结果表明PGE,具有类似于FSH的生理作用,可促进颗粒细胞的增殖。小黄卵泡颗粒细胞上存在PGE受体,FSH可以促进小黄卵泡颗粒细胞合成PGE1,PGE1可通过FSH介导的细胞内PKA信号转导系统促进核内转录因子CREB1的表达,进而促进颗粒细胞的增殖。3.前列腺素和表皮生长因子的互作对颗粒细胞增殖的影响本实验探讨了前列腺素PGE1和表皮生长因子(EGF)间的相互作用对产蛋鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞增殖的影响。用12.5μg/ml的胶原酶将颗粒层分散为单个颗粒细胞,在低浓度血清(0.5%FCS)中预培养16h后换成无血清培养液继续进行培养,同时用药物处理细胞。免疫细胞化学染色结果表明小黄卵泡颗粒细胞表达EGF及其受体EGFR,而且这种表达能被PGE1(1～100 ng/ml)和forskolin(10-7～10-5 mol／1)处理所增强。EGFR的表达同样也能被其配体EGF所增强。选择性环氧合酶(COX)抑制剂SC560(10-7～10-5 mol／l,特异性抑制COX-1)和NS398(10-7～10-5 mol／l,特异性抑制COX-2)抑制了EGF诱导的颗粒细胞的增殖,EGF的这种作用被PCNA免疫细胞化学染色结果证实。尽管EGF促进了颗粒细胞内COX-1和COX-2的表达,但是EGF与特异性的PG合成酶抑制剂联合后再添加PGE,的补救实验发现,PGE-对NS398抑制的EGF诱导的颗粒细胞的增殖的补救效果较SC560明显。这表明COX-2在介导EGF作用的过程中占主导地位。上述结果表明细胞内PG和EGF相互促进合成的作用增强了颗粒细胞的增殖作用,进而促进了等级前卵泡的发育。4.花生四烯酸对颗粒细胞增殖、活性及功能的影响花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是一类顺式多不饱和脂肪酸,是动物细胞膜磷脂的重要组成部分。除了作为前列腺素合成的前体物调节动物生殖过程外,花生四烯酸在调节细胞功能的过程中也起重要作用。本实验运用低浓度血清颗粒细胞体外培养模型探讨了花生四烯酸对产蛋鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞发育及功能的影响。结果发现单独的花生四烯酸、亚油酸和亚麻酸(10-7～10-4 mol／l)对颗粒细胞没有明显的促增殖作用。四甲偶氮唑蓝比色法测定细胞活性发现,花生四烯酸(10-5～10-5 mol／l)可以增强细胞的活性,但当花生四烯酸达10-4mol／l时,细胞活性下降。PKA、PKC免疫细胞化学染色结果发现,花生四烯酸主要通过PKC信号途径发挥作用。此外,花生四烯酸对颗粒细胞功能的研究发现,花生四烯酸(10-7～10-5 mol／l)能够增加细胞外基质成分层粘连蛋白(1aminin,LN)和缝隙连接蛋白Cx43的表达。上述结果表明花生四烯酸通过PKC信号通路增强了细胞活性,并通过促进细胞外基质和细胞间缝隙连接蛋白的合成调控细胞的功能。以上实验结果表明：颗粒细胞在0.5FCS%中预培养16h后换成无血清培养液继续进行培养,同时用药物处理细胞的模型,能够用于研究颗粒细胞的增殖、分化、形态变化以及这种专一性细胞的信号转导途径,并可用于研究与卵泡结构、功能、生长及成熟相关的影响因素的作用及机理。在此模型上发现,PGE1通过FSH介导的细胞内PKA信号转导系统促进EGF、EGFR及核内转录因子CREB1的表达：而EGF主要通过促进COX-2的表达增加了PG的合成,它们形成了一个细胞内的正反馈循环通路,并通过不同信号转导通路的交联,加速了小黄卵泡颗粒细胞的增殖,从而促进了等级前卵泡的发育。而AA通过PKC信号通路,影响颗粒细胞细胞外基质及细胞间缝隙连接蛋白的表达,从而影响颗粒细胞的功能。因此,AA及其代谢物PG可通过改变小黄卵泡颗粒细胞的增殖和分化等功能,进而促进卵泡的发育。这些结果为家禽优势卵泡选择及繁殖性能的提高提供了理论指导和实验平台。