家蚕（Bombyx mori，B.mori）是一种具有很高经济价值和文化价值的泌丝昆虫，以家蚕为基础的蚕桑产业曾是我国经济发展中的功勋产业，在当今我国扶贫攻坚战略中仍发挥着重要作用。家蚕核型多角体病毒（B.mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）病是养蚕生产上最常见的危害最严重的一类蚕病之一，每年给我国蚕桑业产业造成巨大的经济损失。目前，蚕业生产上对BmNPV的防控仍依赖于对蚕室、蚕具、养蚕环境及桑叶的消毒和加强饲养管理等技术措施，并不能从根本上控制病害的发生。随着蚕桑产业向省力化、粗放化和轻简化的方向发展，对家蚕品系的抗病毒能力的要求更高，迫切需要通过现代分子育种手段提高家蚕抗病毒能力。本研究利用规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR/Cas9）基因编辑技术和转基因技术创制了具有高效抗BmNPV的家蚕转基因素材。首先，本研究建立能够编辑BmNPV的基因编辑技术平台；接着，根据BmNPV的侵染机制系统筛选BmNPV复制的关键基因；然后，解析关键靶标基因lef-11调控病毒和宿主的作用机制；最后，优化鉴定转基因素材的抗病毒效果，并对目前家蚕实用品系进行遗传改良研究。论文取得的主要结果和结论如下：　　1.CRISPR/Cas9基因编辑技术体系建立及BmNPV复制关键靶基因筛选　　本研究建立了家蚕介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统，并鉴定了该系统能够有效的编辑外源基因egfp及BmNPV基因组中ie-1基因，确定了CRISPR/Cas9系统基因编辑系统能够有效的编辑外源基因和BmNPV基因组，从而有效地抑制病毒的增殖复制，能够应用于家蚕抗病毒研究；根据BmNPV系统感染路径和DNA复制关键基因，系统性的筛选了BmNPV侵染过程中的关键基因，确定lef-11基因为功能未知的病毒复制关键靶基因；最后，对lef-11基因的转录调控和翻译区域进行基因编辑分析，确定了该基因是BmNPV增殖复制的关键靶基因。高效的家蚕CRISPR/Cas9基因编辑和检测技术平台的建立，为系统性筛选出BmNPV增殖复制关键靶基因奠定了坚实的基础，而系统筛选 BmNPV复制关键基因则为后期家蚕抗病毒研究提供了保障。　　2.BmNPV LEF-11多聚化功能域对病毒DNA复制是必要的　　LEF-11是一个13.1KDa的小分子蛋白，位于BmNPV DNA复制中心，参与病毒DNA复制。本研究对LEF-11蛋白的表达特征进行了检测，亚细胞定位发现LEF-11在细胞中能够聚集到一处，非还原性SDS-PAGE结果表明LEF-11主要以四聚体的形式存在；同时，本研究建立了基于荧光共定位快速检测蛋白互作的方法，确定了LFE-11 C端和N端都存在多聚化现象；进一步通过非还原性SDS-PAGE和荧光共定位确定LEF-11 C端多聚化功能域位于aa42-61，N端多聚化功能域位于aa72-101；通过Bac-to-Bac系统回复缺失多聚化功能域的LEF-11，鉴定了该多聚化功能域对病毒DNA复制是必要的；同时，对LEF-11多聚化功能域疏水性氨基酸定点突变，确定I55、Y58&I59、I85、L88&L89对LEF-11蛋白四聚体形成是必要的；通过把定点突变的疏水性氨基酸回复到lef-11基因缺失型病毒中，鉴定到LEF-11疏水性氨基酸Y42、Y58&I59、I85、L88&L89对病毒DNA复制是必要的。以上结果表明LEF-11蛋白在BmNPV复制过程中是必要的，基本明确了LEF-11在病毒增殖过程中的作用特征和重要性，lef-11基因可以作为家蚕抗病毒靶标基因。　　3.BmNPV LEF-11调控宿主细胞机制研究　　通过酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术，以LEF-11蛋白为诱饵共筛选到11个LEF-11潜在相互作用的蛋白家族；经过酵母双杂交回转和免疫共沉淀验证，确定有6个蛋白与LEF-11具有相互作用，分别是BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI、BmSamui、BmMyosin及BmROBL2；RT-PCR分析互作蛋白转录表达，结果显示除BmIMPI基因在丝腺特异表达和BmMyosin基因在表皮和头部特异表达外，其余基因在各个组织均有表达，在BmNPV感染后，BmIMPI、BmSamui、BmMyosin、BmATADA和BmHSPD1转录水平均有明显上调表达；过表达LEF-11互作蛋白后,病毒DNA复制和Western Blotting结果显示，BmATAD3A和BmHSPD1具有明显的促进病毒增殖作用；敲除LEF-11互作蛋白后，流式分析和Western Blotting显示BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI和BmMyosin都具有明显抑制病毒增殖复制的作用；综合过表达和敲除宿主靶标基因的结果，本研究确定BmATAD3A和BmHSPD1作为深入研究LEF-11调控宿主的关键因子。　　通过抗生素筛选获得BmATAD3A和BmHSPD1过表达的稳定细胞系，流式分析表明BmATAD3A和BmHSPD1具有明显的促进病毒增殖作用；同时基于RNAi和CRISPR/Cas9抑制或敲除BmATAD3A和BmHSPD1基因后，病毒增殖明显受到抑制；BmATAD3A和BmHSPD1基因功能研究表明BmATAD3A和BmHSPD1均能够和线粒体共定位，荧光共定位和免疫共沉淀分析表明它们之间也具有直接的相互作用关系；通过RNAi分析表明BmHSPD1基因对病毒复制的影响主要是受BmATAD3A调控。结合以上结果基本确定了LEF-11调控宿主细胞的网络模型，鉴定了LEF-11调控宿主BmATAD3A和BmHSPD1的作用机制，为解析BmNPV DNA复制机制奠定了基础，为后期家蚕抗病毒素材创新提供了BmATAD3A、BmHSPD1和BmMyosin等重要的宿主靶标基因。　　4.CRISPR/Cas9介导的家蚕抗BmNPV素材创新研究　　通过系统性筛选和基因功能研究，确定了lef-11基因调控病毒和宿主的机制。为应用本研究筛选的靶标基因用于家蚕抗病毒研究，本论文应用CRISPR/Cas9基因编辑技术在家蚕个体上获得了以下抗病育种研究结果：通过转基因技术分别获得了表达Cas9蛋白和sgRNA靶标序列的转基因品系，并通过杂交获得双阳性品系sgRNA×Cas9；sgRNA×Cas9品系基因编辑检测分析显示，该品系够有效的编辑病毒基因，感染24h后基本能够完全编辑BmNPV基因组，一直持续到120h；抗病毒分析表明sgRNA×Cas9杂交品系能够有效抑制BmNPV增殖，感染10天后存活率仍在90%以上，基本检测不到BmNPV分子水平的增殖；经济性状分析表明家蚕基因编辑转基因品系Cas9(-)/sgRNA(-)、Cas9(+)/sgRNA(-)、Cas9(-)/sgRNA(+)和Cas9(+)/sgRNA(+)之间的体重和茧层率没有显著差异。　　CRISPR/Cas9基因编辑技术最大的安全隐患就是脱靶问题，为了能够有效的降低该系统的脱靶效率，本研究构建了基于BmNPV39K启动子启动的诱导型CRISPR/Cas9系统，并证明该系统能够在较低毒力和较短时间内快速激活；对脱靶位点T克隆测序比较分析，BmNPV诱导型和稳定表达的CRISPR/Cas9系统相比，能够显著降低基因编辑脱靶效率；同时抗病毒分析表明BmNPV诱导型CRISPR/Cas9系统能够显著抑制病毒增殖复制。　　为了解决获得转基因品系过程繁琐，验证个体基因编辑效率周期慢等问题，本研究构建了基于杆状病毒表达（BEVS）包装的CRISPR/Cas9系统，该系统直接注射BEVS包装的sgRNA靶标序列的病毒BmNPV-sgRNA到Cas9转基因家蚕个体上，就可直接检测对靶基因的编辑效率。基因编辑分析表明该BEVS包装系统能够有效的编辑BmNPV靶基因lef-11和BmNPV复制的宿主关键因子BmATAD3A及BmHSPD1，候选靶基因可以应用于家蚕抗病毒研究。本研究结合目前中国主推家蚕实用品系，对系统筛选鉴定的靶标因子进行了转基因注射，并获得菁松×皓月和871×871C等的抗病毒转基因品系sgRNA×Cas9。利用以上技术和方法有望快速获得家蚕转基因抗病毒品系，并应用于国内实用品系遗传改良研究。