真菌毒素快速检测适配体试纸条的研究

来源 :江南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lingshao2009
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近年来,食品安全问题频发,严重危害着人们的身体健康,引起了人们的广泛关注。其中真菌毒素污染广、种类多、毒性强,且具有分子量小、结构稳定、不易被分解等特点,受到真菌毒素污染的食物严重影响了大众的身体健康,是食品检测中的关注重点。传统的真菌毒素检测方法一般是仪器法和酶联免疫法,其中大型检测仪器价格昂贵,且需要专业人员操作,无法进行现场检测工作。酶联免疫法显色结果受外界环境干扰较大,且所需抗体的制备周期较长,成本较高,存在批次间差异,且真菌毒素无免疫原性需要合成人工抗原,这也限制了免疫法在真菌毒素检测领域的发展应用。因此,现阶段急需研究和建立一种快速、灵敏、准确、价格低廉、适用于现场的检测方法。适配体作为近年来在检测领域被广泛使用的识别分子,具有可与抗体媲美的亲和力与特异性,且具有靶标范围广泛、制备过程简单、稳定易保存等优点,目前适配体在食品安全检测中的发展受到了研究者们的关注。侧流层析技术作为重要的快速检测手段,在农兽药残留、致病菌检测等食品危害因子检测中应用广泛。将适配体应用于层析试纸条作为识别物质,可以大大提高试纸条的稳定性,降低生产成本,扩大适用范围。此外,上转换发光纳米材料作为近年来新兴的荧光纳米材料,被广泛应用于光学传感器的研制工作中。上转换纳米材料具有斯托克斯位移大、光化学性质稳定、毒性低、没有背景干扰、信噪比较高、不易光漂白等光学特性。通过进一步研究将上转换纳米材料作为信号标记探针应用于适配体识别的层析试纸条中,可以在检测灵敏度、准确性等方面获得优异性能。首先,构建了一种基于适配体识别的新型玉米赤霉烯酮胶体金层析试纸条。将巯基化的玉米赤霉烯酮适配体与胶体金偶联,作为层析试纸条的信号探针;将适配体的识别序列与非识别序列的互补链借助链霉亲和素分别固定于硝酸纤维素膜的表面形成检测线与质控线。该方法采用竞争原理,通过检测线上的互补序列与靶标共同竞争探针上连接的适配体实现对目标物的检测。实验中优化了金标适配体探针制备过程中盐浓度及适配体浓度、检测线与质控线上链霉亲和素与生物素化适配体的比例、上样量等条件,提高了试纸条的灵敏度及稳定性。在最佳的实验条件下,玉米赤霉烯酮试纸条利用适配体高亲和力高特异性的优点,可视化检测线可达到20 ng/mL,且在5 ng/mL200 ng/mL内线性良好且具有良好的特异性。该方法应用于市售玉米样品的检测,具有较好的准确性,可用于实际样品的检测中。其次,构建了一种基于适配体识别的新型赭曲霉毒素A上转换纳米材料层析试纸条。为了进一步提高试纸条检测灵敏度及信号稳定性,本实验通过高温热分解法合成了在近红外光激发下在可见光区具有荧光信号的NaYF4:Yb,Er上转换纳米材料,并将聚丙烯酸作为配体交换剂,通过配体交换法在上转换表面修饰羧基基团,使其具有更好的生物相容性。将赭曲霉毒素A的氨基化适配体与改性后的上转换材料偶联,作为层析试纸条的探针;将适配体的识别序列与非识别序列借助链霉亲和素分别固定于硝酸纤维素膜的表面形成检测线与质控线。该方法采用竞争原理,通过检测线上的互补序列与靶标共同竞争探针上连接的适配体,实现对目标物的检测。实验中优化了上转换材料的制备及表面改性方法、硝酸纤维素膜的孔径、上样量等条件,确保了信号探针在试纸条上的流动性,避免背景干扰。在适配体高亲和力高特异性的基础上将上转换材料作为标记物应用于试纸条上,利用其独特的光学性质,进一步提高了试纸条的灵敏度及稳定性,同时达到定量检测的目的。在最佳的试验条件下,赭曲霉毒素A检测限为1.86 ng/mL,且在5 ng/m L100 ng/mL内线性良好,且具有较好的准确性。该方法应用于市售啤酒样品的检测中,具有较好的准确性,可用于实际样品的检测中。
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