研究背景烧伤后创面愈合问题显著降低了患者的心理和身体的生存质量,甚至会威胁他们的生命。近年来许多治疗方法应用到临床创面治疗上,包括干细胞治疗,但是目前依然没有完美有效的治疗方法。因此,我们急需一种完美修复创面而且价格又可以承受的治疗方法应用于烧伤的创面治疗。表皮干细胞主要来源于皮肤基底层,占基底层细胞数的2%4%,具有分化为表皮角质形成细胞和皮肤其他附属器官的潜能,并且是皮肤组织创伤再生和修复的理想的种子细胞。表皮干细胞的表面标记物有Cytokeratin(CK)19和lntegrin-β 1(β 1),分化为成熟的角质形成细胞后则CK10表达阳性。CD271,是神经生长因子的受体,即p75受体,可以调节多种干细胞的增殖、凋亡和分化,并且还有研究表明CD271可能在促进皮肤的创面愈合过程中起着重要作用,然而表皮干细胞中的CD271促进创面愈合的具体机制却不明了。作为神经生长因子的另一个受体TrkA,既往研究提示CD271和TrkA可以互相调控彼此的表达,CD271和TrkA的比率关系也可以影响细胞的增殖能力等。然而在皮肤中,尤其是表皮干细胞中CD271是否受到TrkA的调控作用并不明确。另外ERK、AKT和JNK信号通路也可能参与皮肤的创面愈合过程。本实验意在研究在皮肤创面愈合过程中,CD271的过表达的表皮干细胞是否可以促进创面愈合,以及CD271是否联合TrkA在创面愈合过程中通过促进表皮干细胞的迁移和增殖进而促进创面愈合。目的探讨CD271是否影响表皮干细胞的生物学特性及是否促进创面愈合,并且进一步研究表皮干细胞中的TrkA在CD271引起的创面愈合过程中的作用和机制。材料和方法1、体外细胞实验(1)表皮干细胞的分离培养本实验所涉及到的动物实验的处理依从山东大学动物伦理委员会的行为规范。提取新出生的乳鼠皮肤,使用25%的戊巴比妥溶液麻醉乳鼠,处死乳鼠,75%的酒精消毒皮肤,铺巾,取下乳鼠背部腹部的全部皮肤,放入2~3ml冰的PBS溶液中。在超净台操作,采用DispaseII酶消化的方法取下表皮层,丢弃真皮层,将剥离的表皮层用PBS冲洗三次,使用无菌剪刀剪碎,放入0.05%的胰酶室温下消化10分钟,用表皮细胞的全培养基终止消化,用200目的滤网过滤后,l000rmp,5分钟,室温离心,弃去上清,加入适量的表皮干细胞专用KSFM培养基(Serum-free medium,Gibco)混匀,放入37℃、5%CO2的细胞孵育箱里面培养。3天后更换培养基,提前预热37℃的PBS轻轻冲洗不能贴壁的细胞,当细胞长到80%~90%以上的时候给予传代。(2)转染慢病毒把表皮干细胞(P3)铺在96孔板里,培养24小时,然后提前一天转染慢病毒,以1×105/孔的细胞铺到24孔板中。培养细胞数量为2×105/孔左右,转染慢病毒。用含6 u g/ml polybrene的2~3ml新鲜的培养基替换旧的培养基后,然后再加入适量的病毒悬液。37°C孵育。4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。继续培养细胞,再用新鲜培养基替换原来含有病毒的旧的培养基,再继续培养细胞。用敲除了 CD271的慢病毒(含有荧光蛋白),在转染病毒48小时后,转染效率高,可见有很多荧光表达,72小时后会更加明显。(3)应用K252a降低TrkA的表达将CD271正常表达和CD271过表达的表皮干细胞培养在表皮干细胞专用培养基中并铺板使密度大概为1× 105左右,并使用100nM K252a(Santa Cruz Biotechnology Company,CA)预处理 24 小时。(4)细胞增殖能力检测将CD271过表达、低表达及正常对照组表皮干细胞(P4),以及给予K252a试剂干预后的表皮干细胞使用细胞克隆、CCK-8和细胞增殖检测试剂盒等方法进行检测。(5)细胞迁移能力检测为了检测细胞的迁移能力,我们使用了 Transwell实验。小室膜孔径8 μm,各组细胞种于小室上层,小室上层为无表皮生长因子的培养基,下层为表皮干细胞专用培养基。用孵箱培养各组细胞24小时,用PBS冲洗,再用棉签擦去Transwell上室内的细胞,用95%的乙醇固定微孔膜下层的细胞,再苏木素染色2分钟,通过采用表皮生长因子作为诱导,计数相同面积下穿透聚碳酸酯膜的细胞数量,以此判断细胞的迁移能力。(6)细胞凋亡能力检测流式细胞术可以用于检测表皮干细胞的凋亡能力。Q2代表着凋亡的比率,Q4代表着死亡的比率。将表皮干细胞,大约IX 106个细胞每孔,消化下来再用5 μ 1的PE-7-AAD和Annexin-V-FITC染色,在室温下避光染色15分钟。Hoechst 3342/PI或者TUNEL/DAPI双染实验检测细胞的凋亡。将处理过的的表皮干细胞,大约1×106个细胞每孔,提前24小时种到24孔板里。再用PBS清洗后,Hoechst33342/PI或者TUNEL/DAPI加入到培养基里并孵育15分钟。在荧光显微镜底下观察,并即时拍照计数死亡和所有的细胞。2、体内动物实验(1)深II度烧伤模型设计随机抽取C57BL/6小鼠(6周,雄性,2025克)。首先给予25%戊巴比妥溶液麻醉6周龄的雄性小鼠,35mg/kg,成功麻醉后,将小鼠背毛剃除干净,碘伏酒精消毒,在100℃水浴直径0.5厘米的铜块放于小鼠背部4秒钟,制作深II度烧伤模型。动态观察小鼠烧伤创面愈合的过程,在0天、7天、14天和21天分别取材。(2)皮肤全层缺失的模型设计C57BL/6小鼠(6周,雄性,20～25克),给予正常饮食,将小鼠麻醉(给予25%戊巴比妥,35mg/kg),剃去小鼠的毛发,并75%酒精消毒,使用直径大小0.5厘米的模具在小鼠背部制作创面,然后使用5ml的林格液复苏麻醉的小鼠。在0天、3天和7天拍照测量创面面积,并在7天时取小鼠创面包括周边2mm的皮肤,用于做免疫组织化学染色和Western blot实验分析。(3)K252a药物抑制TrkA表达的动物模型制备K252a 是 TrkA 受体的抑制剂[36,37]。购自 Santa Cruz Biotechnology 公司。15μgK252a(10μg/mg)溶解在含2%的DMS0的生理盐水中,在-20°C的黑暗环境中保存。C57BL/6小鼠(20~25克,雄性,6周)随机分成4组,每组5只。在Control组和CD271组腹腔注射含2%DMS0的生理盐水,在K252a组和CD271+K252a组则注射溶解有K252a药物的2%DMS0生理盐水(5μg/kg)。提取皮肤组织蛋白,Western blot方法检测TrkA的表达情况。(4)表皮千细胞干预创面愈合的实验4.1 C57BL/6小鼠(6周,雄性,20~25克)随机分组,每组6只小鼠,按照上述的步骤制作深II度烧伤模型。将等体积(150 μl PBS)且等细胞数量(1X 10～7)的四代CD271正常表达和CD271过表达的表皮干细胞注射到制作创面后的当天、3天和5天的创面周围5mm的真皮层。随后在当天、7天、14天和21天时测量创面面积并拍照。创面的面积采用游标卡尺测量。在第21天的时候取创面及周边的皮肤,检测相关指标的表达情况。4.2使用K252a(5 μg/kg)腹部注射制作TrkA表达缺失的小鼠模型。Western blot检测在皮肤组织中TrkA表达缺失后,按照上述描述(2)制作直径0.5厘米的皮肤全层缺失的创面模型。同理将等体积且等细胞数量的正常及CD271过表达的表皮干细胞注射到制作创面后的当天、3天和5天的创面周围皮肤的真皮层中,然后在当天、3天和7天时测量创面面积并拍照。在第7天的时候取创面及周边的皮肤,检测相关指标的表达情况。(5)免疫组织化学染色1)脱蜡:60°C条件下烘片,将片子然后依次放入无水的乙醇,95%的乙醇,85%的乙醇,70%的乙醇和蒸馏水中,2)抗原修复:把抗原修复液预热,再把切片放入修复液中,继续加热约1分钟后关掉电源,自然冷却到室温,3)免疫组织化学染色的实验过程:内源性过氧化物酶室温下封闭20~30分钟后;然后按照一抗说明书稀释一抗(β 1,CD271,CK19和CK10),滴加一抗后4°C过夜孵育;37°C下滴加Polymer helper后孵育20～30分钟;在37°C下滴加生物素化二抗后孵育20～30分钟;最后用DAB染色后在显微镜底下观察;最后用苏木素染色;等片子干燥后封片,加中性树胶覆盖片子,晾干;显微镜拍照。(6)Western blot 检测按照实验步骤提取各组细胞和动物皮肤组织中的蛋白,灌胶、电泳、转膜孵育一抗过夜后,显影检测实验中CD271和表皮干细胞表面标记物,如CK10、CK19和β 1的表达。同时测定磷酸化Akt,ERK和JNK信号通路的表达变化情况。3、统计学分析对上述实验数据使用SPSS 17.0软件进行统计学分析。两组之间正态分布的数据的比较使用单因素方差分析,t检验。多组之间数据的比较使用AN0VA检验。本实验研究中所得的数据均使用(平均值土标准差)表示。当P<0.05的时候,说明数据具有明显的统计学意义。实验结果1、细胞实验(1)CD271调控表皮干细胞的分化表皮干细胞的分化能力在皮肤创面愈合过程中发挥作用。因此我们实验研究了 CD271在表皮干细胞中的分化作用。将表皮干细胞培养在胶原包被的培养瓶中,通过转染慢病毒我们得到CD271过表达的表皮干细胞(CD271-vo eSCs)和CD271低表达的表皮干细胞(CD271-kd eSCs)以及转染了空病毒的对照组表皮干细胞(Control eSCs)。可以通过判断带有绿色荧光的细胞来判断病毒是否转染细胞成功,并可以粗略判断转染效率。免疫组织化学染色和Western blot结果显示我们得到CD271-vo表皮干细胞和CD271-kd表皮干细胞以及对照组表皮干细胞。CD271在表皮干细胞的分化作用利用CK10、CK19和β 1的表达量多少来表示。当CD271过表达时,CK10表达升高而CK19表达下降,相反的,当CD271低表达时,CK10表达降低而CK19和βl表达升高。这些结果表明CD271可以有效的调控表皮干细胞的分化。(2)CD271调控表皮干细胞的增殖凋亡和迁移能力接下来我们检测了 CD271对于表皮干细胞凋亡和增殖方面的影响。我们使用了流式细胞术、细胞克隆和CCK-8等方法检测细胞的增殖。对比Control组表皮干细胞,CD271-vo表皮干细胞G2期增多,CD271-kd表皮干细胞G2期减少。在细胞克隆和CCK-8测细胞增殖的实验中我们也可以得到类似的结果。表皮干细胞的凋亡能力用Hochest/PI染色、TUNEL/DAPI染色和流式细胞术检测,得到跟增殖能力测定实验观点一致的结论。Transwell实验用来检测细胞的迁移能力,CD271-vo表皮干细胞的迁移能力增高而CD271-kd表皮干细胞迁移能力下降。这些结果显示CD271促进了表皮干细胞的增殖能力和迁移能力。(3)CD271可以调节TrkA的表达TrkA是神经生长因子的另一个受体。有研究表明TrkA和CD271表达的比率可以通过神经生长因子影响细胞的增殖和存活。所以我们使用了免疫组织化学染色和Western blot对TrkA在细胞中的表达情况进行了检测。当CD271表达增高时TrkA表达降低,当CD271表达降低时TrkA表达增高。(4)K252a抑制表皮干细胞的TrkA表达后,CD271过表达的表皮干细胞的凋亡能力增加前文已经说到,K252a是抑制TrkA受体的试剂。通过转染慢病毒和加药,我们得到对照组的表皮干细胞(Control eSCs),CD271过表达的表皮干细胞(CD271 eSCs),与K252a共培养的正常表皮干细胞(K252a eSCs)和CD271过表达的表皮干细胞(CD271 eSCs+K252a)。通过流式细胞术检测Control组,CD271 eSCs组,K252a eSCs组和CD271 eSCs+K252a组这四组细胞表达CD271的情况。我们采用流式细胞术测Q2+Q4的比率水平来比较各组之间凋亡能力。我们发现与不加K252a的Control组和CD271 eSCs组相比,加K252a后的两组的Q2+Q4比率均增高,并且CD271过表达同时TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a组在各组中凋亡水平的增高是最明显的。与TUNEL染色结果一致。TrkA抑制后即使CD271过表达,也会增加表皮干细胞的凋亡能力。(5)K252a抑制表皮干细胞的TrkA表达后,CD271过表达的表皮干细胞的增殖能力降低K252a是常用的抑制TrkA表达的抑制剂。通过Western blot判断TrkA被抑制的效率,我们的实验中TrkA完全抑制表达,然后再做流式细胞术测定细胞周期。我们发现与不加K252a组相比,加K252a后的两组的G2期均下降,并且CD271过表达同时TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a组在各组中是增殖能力降低最明显的。与细胞克隆实验结果一致。TrkA抑制后即使CD271过表达也可以降低表皮干细胞的增殖能力。(6)K252a抑制表皮干细胞的TrkA表达后,CD271过表达的表皮干细胞的迁移能力下降K252a是抑制TrkA受体的试剂。我们Transwell实验测细胞穿膜的细胞数目水平来比较各组之间迁移能力。我们发现与不加K252a的Control组和CD271 eSCs组相比,加K252a后的K252a组和CD271+K252a组的穿过膜的细胞数目显著减少,并且CD271过表达同时TrkA抑制的表皮干细胞组在各组中是穿出细胞数目是最少的。TrkA抑制后可以降低表皮干细胞的迁移能力,并且CD271过表达但TrkA不表达也会引起表皮干细胞的迁移能力下降。(7)抑制TrkA表达后,ERK和Akt信号通路的表达降低为了探索可能参与的信号通路,我们提取了 Control组的表皮干细胞,CD271 eSCs组的表皮干细胞,与K252a共培养的K252a eSCs组表皮干细胞和CD271eSCs+K252a组的表皮干细胞这四组细胞的蛋白。利用Western blot的方法测定了 pERK,pAkt和pJNK的蛋白表达水平变化。与Control组的表皮干细胞相比,pERK和pAkt在CD271 eSCs中表达增多,而且在CD271 eSCs+K252a中表达最少。同时发现表皮干细胞与K252a共培养时,pJNK表达增高,并且与CD271的表达高低无关。2、动物实验(1)CD271在烧伤创面愈合过程中表达增多检测CD271在创面愈合过程中的变化情况,CD271表达在创面愈合的中、后期表达越来越高。把在100°C沸水中浸的铜块放在已经剃除毛发的小鼠背部4秒钟,得到深II度烧伤的创面模型。深II度烧伤会累及残留了表皮干细胞的皮肤的表皮层及真皮层。通过检测表皮干细胞的表面标记物(CK19、β1),我们发现表皮干细胞在创面愈合过程中不断增加,参与创面愈合的过程。我们可以看到创面在第7天和14天时开始愈合,并在第21天时完全愈合。我们在创面愈合过程不同的阶段取材,动态观察创面愈合的过程。我们发现CD271在第7天的时候下降了,但是在第14天和21天时表达增高了。然而CK10在第7天的时候表达降低,而在第14天和21天时表达增高。而免疫组织化学染色显示,CD271和CK19在创面愈合过程中主要表达在增厚的表皮层。β1在基底层也表达增高了。CK19的表达在第7天的时候减少了,在第21天的时候增加。这些结果表明伴随着表皮干细胞的增加,CD271参与创面中、晚期愈合过程。(2)CD271过表达的表皮干细胞可以促进创面愈合通过CD271正常表达和CD271过表达的表皮干细胞干预创面愈合以此判断CD271对创面愈合情况的影响。与注射CD271正常表达的表皮干细胞相比,注射CD271过表达的表皮干细胞的创面在愈合时间和愈合质量上都有提升。这些结果表明CD271过表达的表皮干细胞更加可以促进创面愈合。(3)TrkA可以辅助CD271促进创面的愈合通过腹腔注射K252a(5ug/kg)得到TrkA表达缺失的小鼠,取小鼠皮肤提取蛋白,通过Western blot方法验证得到皮肤中TrkA表达缺失的小鼠模型。制备好全层皮肤缺失的小鼠。愈合模型实验:将小鼠分为给予正常表达表皮干细胞的正常对照组(Control组),给予CD271过表达表皮干细胞的CD271组,预处理过K252a的给予CD271正常表达的表皮干细胞的K252a组和预处理过K252a的给予CD271过表达的表皮干细胞的CD271+K252a组。在术后的当天、3天和5天的时候,Control组和K252a组给予CD271正常表达表皮干细胞,CD271组和CD271+K252a组给予CD271过表达表皮干细胞的处理。在创面的周边皮肤5mm,注射到皮肤的真皮层。从第3天开始,我们可以看到CD271过表达组创面愈合最快,CD271+K252a愈合最慢,但是在TrkA阻滞后的情况下,CD271过表达并不能引起创面的愈合加快。取上述各组创面愈合第7天时的皮肤组织,进行相关的实验得出,CD271+K252a组的创面愈合边缘,集聚着数量最少的处在增殖期的细胞,和最少量的表皮干细胞。结论我们的实验揭示了CD271促进表皮干细胞的分化、增殖和迁移,CD271在深II度烧伤创面愈合过程的中、后期,也就是再上皮化和重构过程中的起着重要作用。目前的发现可以将CD271和表皮干细胞视作很有前途的治疗创面愈合的靶点。CD271在创面的早期降低,而在中、后期增高,表明CD271在创面愈合的中、后期阶段起作用。我们在创面愈合的早期通过表皮干细胞干预创面的愈合进程,得出表皮干细胞可以促进创面愈合,而CD271可以加速表皮干细胞的增殖分化和迁移,以此促进皮肤的创面愈合过程的结论。除此之外,神经生长因子的另一个受体TrkA的表达在CD271过表达的表皮干细胞中表达降低了。之前的研究显示TrkA的作用不明确,可能促进,也可能抑制细胞的生物学特性,也有实验表明TrkA和CD271的比率会影响细胞的生物学行为。因此为了进一步明确TrkA在CD271促进创面愈合的作用,在后续的实验中,我们抑制TrkA的表达后发现即使CD271的增高并不会引起表皮干细胞的促进创面愈合作用。即在CD271的过表达的情况下,TrkA受体的存在可能启动了比率机制引起表皮干细胞的增殖和迁移。本实验还展示了在促进创面愈合过程中,CD271和TrkA可能会通过ERK和Akt信号通路起作用。综上所述,这项实验阐述了 CD271可以通过促进表皮干细胞的增殖分化迁移促进创面愈合;CD271联合TrkA在创面愈合过程中起着重要作用,而且表明了一个潜在的机制——在TrkA存在的条件下,CD271通过促进表皮干细胞的增殖和迁移进而可以促进皮肤创面的愈合。