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目的:在本实验室前期生物信息学和实验研究的基础上,本研究通过在体外诱导分泌白细胞介素17的辅助性T(Interlukin-17 producing helper T,Th17)细胞和调节性T(regulatory T,Treg)细胞,探讨肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)及白细胞介素6(Interlukin-6,IL-6)等通过调控miR-34a和miR-31的表达,继而miRNAs引起Treg细胞中叉头/翼状螺旋转录因子3(Forkhead/winged helix transcription factor 3,Foxp3)的表达水平的变化,使得表达Foxp3的Treg细胞与表达维甲酸相关核孤儿受体γt(RAR-related orphan receptor gamma,RORγt)的Th17细胞间的比例失衡,进一步导致以异常炎症反应为特征的自身免疫性疾病的发生。部分阐明在炎症因子的作用下miRNAs导致Treg/Th17细胞失衡的机制有助于更深入地揭示一些自身免疫性疾病的发病机制,为自身免疫性疾病的治疗提供理论依据。方法:在以往生物信息学预测的基础上,首先验证miR-34a、miR-31与Foxp3表达的相互关系。利用DNA重组技术构建表达小鼠miR-31的慢病毒质粒和逆转录病毒质粒(p LV-miR-31及MGP-31),将pLV-miR-31,MGP-31及本实验室前期构建的pSMPUW-miR-34a与表达小鼠Foxp3基因的pCDNA-m Foxp3-3’-UTR(PFU)真核重组质粒共转染至人胚肾293T(HEK-293T)细胞,通过实时定量PCR技术(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测Foxp3转录水平的变化,免疫印迹技术(Immunoblot)检测Foxp3翻译水平的变化。此外,采用转化生长因子β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)分别与小鼠外周CD4+T细胞和小鼠T淋巴瘤细胞系EL4细胞共培养体外诱导Treg细胞和Foxp3~+EL4细胞,分别检测miR-34a及miR-31与Foxp3表达水平的相关性。接下来,为进一步验证炎症因子是否参与调控miR-34a和miR-31,采用免疫磁珠纯化CD4+CD62L+的初始T细胞(Na?ve T cells)经抗小鼠-CD3及抗小鼠-CD28单克隆抗体(antimouse CD3/CD28 mAb)活化,加入炎症细胞因子组合体外诱导Th17细胞,胞内染色鉴定CD4+IL-17+Th17细胞的百分比以评估Th17细胞的纯度,并采用qpcr测定mir-34a及mir-31的表达水平。同时,利用il-6及tnf-α这两类th17细胞相关的炎症细胞因子分别刺激小鼠cd4+t和el4细胞,利用qpcr检测炎症因子作用下mir-34a及mir-31的表达水平,并通过immunoblot检测nf-κb磷酸化的水平及foxp3的蛋白表达水平。最后,在il-6和tnf-α等炎症因子模拟的微环境中以及核转录因子κb(nucleartranscriptionfactor-kappab,nf-κb)信号活化和抑制的调节下,利用qpcr检测mir-34a及mir-31的表达水平,并通过流式细胞术(flowcytometry,fcm)及immunoblot技术检测foxp3的蛋白水平以分析其信号转导通路。结果:dna测序结果表明,所构建慢病毒重组质粒plv-mir-31及逆转录病毒重组质粒mgp-31中mir-31的前体序列正确;qpcr及immunoblot结果表明mir-34a不抑制foxp3的mrna水平,但可抑制foxp3的蛋白表达水平,而mir-31既可抑制foxp3的mrna水平也可抑制foxp3的蛋白水平。在tgf-β诱导的itreg与foxp3~+el4细胞中,mir-34a及mir-31表达水平下调同时foxp3表达上调,表明mir-34a及mir-31与foxp3的表达水平呈负相关。采用白细胞介素1β(interlukin-1beta,il-1β)、il-6、白细胞介素-23(interlukin-23,il-23)、tgf-β、γ-干扰素中和抗体(interferon-gammaneutralizingantibody,anti-ifn-γ)和白细胞介素-4中和抗体(interlukin-4neutralizingantibody,anti-il-4)等炎症因子在体外与初始t细胞共培养诱导高纯度的th17细胞中,mir-34a及mir-31在th17细胞中表达水平显著升高,提示某些炎症细胞因子参与调节mir-34a及mir-31的转录活性。单独采用il-6或tnf-α与小鼠cd4+t细胞或el4细胞共育时,il-6和tnf-α均可上调mir-34a及mir-31的表达,同时上调nf-κb磷酸化水平并抑制foxp3的翻译。el4细胞加入nf-κb抑制剂(bay11-7082)可下调mir-34a及mir-31,并逆转了nf-κb对foxp3的翻译水平抑制的效应。结论:炎症微环境中的细胞因子如il-6及tnf-α通过激活nf-κb信号通路,促进mir-34a及mir-31的转录,上调的mir-34a及mir-31通过抑制foxp3的转录和(或)蛋白水平,构成了il-6/tnf-α-nf-κb-mir-34a/mir-31信号轴,从而导致foxp3~+treg/rorγt+th17细胞比例失衡,进一步促进了自身免疫性疾病的发生发展。