【摘 要】
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研究背景和目的:肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是中枢神经系统常见的一种进行性复杂性疾病,其确切发病机制目前还不清楚。遗传与环境因素均在其发生发展过程中起重要作用,但共同的作用机制尚不明确,表观遗传学可能是两者相互作用的桥梁,基因曱基化研究有望成为ALS诊断及治疗的突破。本研究应用Human Methylation 850K芯片检测ALS患者与正
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研究背景和目的:肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是中枢神经系统常见的一种进行性复杂性疾病,其确切发病机制目前还不清楚。遗传与环境因素均在其发生发展过程中起重要作用,但共同的作用机制尚不明确,表观遗传学可能是两者相互作用的桥梁,基因曱基化研究有望成为ALS诊断及治疗的突破。本研究应用Human Methylation 850K芯片检测ALS患者与正常对照者血液DNA全基因组甲基化的差异,分析得出异常曱基化位点及基因。选取代表基因验证以及功能研究,以期发现新的ALS诊断及治疗标志物。方法:1、采集ALS患者与正常对照者晨起空腹肘正中静脉血,提取全基因组DNA进行血液DNA全基因组甲基化的差异检测,分析差异甲基化位点,并按照基因注释分类和Cp G岛注释分类进行差异甲基化区域分析,同时对预测结果进行GO通路富集分析。2、选取PCSK9作进一步的验证和功能分析。根据UCSC搜索和Li Lab网上预测PCSK9基因启动子区是否存在甲基化位点,并利用甲基化特异性PCR（MSP）法检测PCSK9基因的甲基化情况。采用q RT-PCR和ELISA检测ALS患者与正常对照者外周血样本中PCSK9 m RNA和蛋白表达水平。3、建立ALS细胞模型并培养,体外研究PCSK9甲基化对ALS细胞模型的作用。MSP法检测模型组和对照组PCSK9甲基化水平;q RT-PCR和western blot检测模型组和对照组PCSK9 m RNA和蛋白的表达水平;western blot检测模型组和对照组甲基化转移酶DNMT1和DNMT3A的表达水平;采用甲基化转移酶抑制剂5-Aza-Cd R处理ALS细胞,检测对细胞凋亡和细胞凋亡相关蛋白表达的影响以及对PCSK9表达的影响;在ALS模型组细胞中转染PCSK9过表达载体及对照,或PCSK9 si RNA及对照,检测对细胞凋亡和对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果:1、DNA全基因组甲基化的差异的检测分析发现实验组与对照组一共涉及到76个基因出现甲基化差异性改变（|beta.difference|＞0.8）,甲基化水平升高基因44个,下调的32个;按基因注释分类和Cp G岛注释分类进行差异甲基化区域分析,结果表明除SSHELF以外的区域均有差异化位点;本试验中GO富集分析结果显示出样本中多个与GO数据库功能区显著相关的差异甲基化区域（DMR）相关基因,所在区域涉及细胞组分、生物学过程以及分子功能。2、根据UCSC搜索和Li Lab网上预测发现PCSK9启动子存在一个甲基化位点;MSP法检测20例ALS患者样本和10例对照组样本PCSK9基因的甲基化情况发现PCSK9基因启动子区在ALS样本中发生部分甲基化;采用q RTPCR和ELISA检测两组外周血样本中PCSK9 m RNA和蛋白表达水平,结果表明,与对照组相比,ALS组的PCSK9 m RNA和蛋白表达水平显著降低。3、MSP检测PCSK9甲基化水平,结果表明Control组甲基化水平不显著,ALS细胞中出现显著升高的甲基化水平;q RT-PCR和western blot检测PCSK9m RNA和蛋白的表达水平,结果表明与对照组相比,ALS细胞中PCSK9m RNA和蛋白的表达水平显著降低;western blot检测甲基化转移酶DNMT1和DNMT3A的表达水平,结果表明与对照组相比,ALS细胞中DNMT1和DNMT3A蛋白的表达水平显著升高;采用甲基化转移酶抑制剂5-Aza-Cd R处理ALS细胞,结果表明5-Aza-Cd R显著抑制了ALS细胞的凋亡以及凋亡相关蛋白的表达,显著升高了ALS细胞PCSK9的m RNA水平和蛋白水平;过表达PCSK9抑制了ALS细胞凋亡,干扰PCSK9促进了ALS细胞凋亡。结论:本研究应用全基因组DNA甲基化芯片技术,全面探讨了ALS全基因组甲基化特征。并采用甲基化特异性PCR（MSP）检测PCSK9在ALS和对照组的甲基化水平差异,证实ALS患者存在血清PCSK9基因启动子区甲基化的异常,提示检测该指标可作为ALS诊断的生物学标志物。通过ALS细胞模型实验验证PCSK9甲基化促进了ALS细胞凋亡。本研究成果有助于对ALS发病机制的研究提供新的思路和方法。
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