【摘 要】
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目的:探讨第一代非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor,EGFR-TKIs）吉非替尼（Gefiti nib）耐药的产生与自噬受体分子1（Neighbor of Brca1,NBR1）介导的主要组织相容性复合体I（Major Histocompatibility Complex
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目的:探讨第一代非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor,EGFR-TKIs）吉非替尼（Gefiti nib）耐药的产生与自噬受体分子1（Neighbor of Brca1,NBR1）介导的主要组织相容性复合体I（Major Histocompatibility Complex,MHC-I）自噬降解重塑肺腺癌TKIs耐药微环境是否存在相关性,以及NBR1与MHC-I分子表达与肺腺癌患者临床病理特征、3年生存期和TKIs获得性耐药复发之间的相关性,为进一步攻克EGFR-TKIs耐药的分子机制提供理论依据。方法:1.选择初诊未治疗的EGFR阳性肺腺癌患者手术或穿刺标本及接受TKIs药物治疗后耐药复发患者的穿刺标本;采用免疫组织化学方法检测肺腺癌细胞中MHC-I、NBR1表达情况、组织中CD8+T淋巴细胞浸润情况,采用卡方检验法分析MHC-I、NBR1以及CD8+T淋巴细胞与耐药之间的相关性;采用Kaplan-Meier生存分析法绘制生存曲线;采用Spearman检验方法分析MHC-I与NBR1相关性。2.根据实验需要将质粒成功构建入慢病毒载体后,利用病毒颗粒转染PC9细胞（exon19del.E746-A750）,将目的基因过表达或沉默。然后对EGFR突变PC9细胞进行不同的处理,分为5组:（1）TKIs单独诱导组,（2）NBR1过表达组;（3）TKIs诱导联合NBR1沉默组;（4）TKIs诱导联合自噬抑制剂组;（5）未处理组。通过采用免疫蛋白印迹法,检测上述不同处理组MHC-I及NBR1的表达水平;采用免疫荧光法,检测上述不同处理组肺腺癌细胞MHC-I与溶酶体关联膜蛋白（Recombinant Lysosomal Associated Membrane Protein 2,LAMP2）共定位情况。3.应用健康人群外周血CD8+T淋巴细胞与上述5组细胞进行共培养后,采用流式细胞术,检测CD8+T淋巴细胞Ki67、分泌颗粒酶（Granzyme B）及穿孔素（Perforin）的表达水平,以及与其共培养的肺腺癌PC9细胞凋亡诱导水平。4.运用SPSS 26.0进行数据统计学处理,采用χ~2检验或Fisher的精确检验,应用Kaplan-Meier绘制生存曲线等,检验水准为p＜0.05。结果:1.免疫组化结果发现初诊未治肺腺癌患者的肿瘤细胞表面可见着色的MHC-I,NBR1表达弱阳性,CD8+T淋巴细胞浸润多;而TKIs药物复发耐药肺腺癌患者肿瘤细胞胞膜MHC-I蛋白表达降低,NBR1表达显著增高,CD8+T淋巴细胞浸润减少。而且MHC-I低表达、NBR1高表达以及CD8+T淋巴细胞浸润减少与肺腺癌患者复发耐药之间存在正相关性,MHC-I及NBR1蛋白表达之间呈负相关。2.免疫蛋白印记法及免疫细胞荧光实验等体外实验结果表明,TKIs触发溶酶体自噬从而引导NBR1介导的MHC-I降解;3.将不同处理组PC9细胞与CD8+T淋巴细胞体外共培养,采用流式细胞术,检测CD8+T淋巴细胞Ki67、Granzyme B、Perforin分泌水平以及肿瘤细胞凋亡水平;与对照组相比,单独使用TKIs诱导组及单纯NBR1过表达组中CD8+T淋巴细胞Ki67、Granzyme B、Perforin分泌水平以及肿瘤凋亡水平显著减低;使用TKIs诱导联合NBR1沉默组和使用TKIs诱导联合自噬抑制剂氯喹组与单独使用TKIs诱导组相比,CD8+T淋巴细胞Ki67、Granzyme B及Perforin分泌水平和肿瘤细胞凋亡水平增高。结论:1.TKIs药物可诱导促使NBR1表达增高,从而诱导膜表面MHC-I通过NBR1介导进入溶酶体-自噬途径发生降解,导致肿瘤细胞表面抗原呈递异常,CD8+T淋巴细胞无法识别肿瘤细胞,致使肿瘤微环境抑制和耐受,无法协同TKIs药物发挥抗肿瘤的效应,最终导致TKIs获得性耐药,2.本研究进一步阐明TKIs诱发NBR1介导MHC-I自噬降解从而导致的免疫微环境抑制是TKIs获得性耐药机制之一,为NBR1可能成为未来攻克肺腺癌耐药的靶点之一提供理论基础。
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