论文部分内容阅读
目的:前期我们实验小组使用芯片技术筛选,通过对肝癌和癌旁肝组织检测发现了肝癌中Paip1蛋白表达量是上调的。本研究拟通过应用慢病毒载体介导的RNA干扰技术,使肝癌细胞中Paip1基因的蛋白表达量下调,观察沉默Paip1基因对肝癌细胞迁移、增殖能力影响,进而探索Paip1基因在肝癌的发生发展中所起的作用。研究方法:1.通过Western Blot方法在蛋白水平检测Paip1在四种不同人肝癌细胞株HepG2,HepG2.2.15,SMMC-7721,Hep3B中和人肝细胞株L02细胞中的表达差异;2.在肝癌Hep G2细胞和SMMC-7721细胞中采用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默Paip1基因表达,用倒置荧光显微镜下观察感染效率,通过Western blot方法检验沉默效果。并且通过使用嘌呤霉素筛选出慢病毒感染的稳定细胞(SMMC-7721-LV-sh-Paip1和HepG2-LV-sh-Paip1,SMMC-7721-sh-eGFP和HepG2-sh-eGFP),通过细胞划痕愈合实验、CCK-8实验观察Paip1基因沉默后细胞迁移和细胞增殖能力的变化;采用Western blot方法检测Paip1基因沉默后PDCD4蛋白水平变化。研究结果:1.Paip1蛋白表达水平在人肝癌细胞株HepG2,HepG2.2.15,SMMC-7721,Hep3B中较人肝细胞株L02明显高(P<0.05),我们从中选出两株肝癌细胞株(HepG2和SMMC-7721)完成接下来的细胞实验。2.采用慢病毒介导RNAi干扰人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721细胞后,用荧光显微镜下观察GFP表达情况,约90%细胞发出绿色荧光,感染效率高;Western Blot检测结果显示HepG2和SMMC-7721细胞实验组均能能有效的下调Paip1蛋白水平。3.划痕24小时后,感染LV-sh-Paip1慢病毒(目的组)的肝癌HepG2细胞的迁移面积变化较阴性对照组小(P<0.01);划痕24小时后,感染LV-sh-Paip1慢病毒(目的组)的肝癌SMMC-7721细胞迁移面积变化较阴性对照组减小(P<0.01)。4.感染LV-sh-Paip1慢病毒组(目的组)肝癌HepG2细胞的增殖能力较相应的阴性对照组及空白对照组亦下降(抑制率为48.60%);感染LV-sh-Paip1慢病毒组(目的组)肝癌SMMC-7721细胞的增殖能力较相应的阴性对照组及空白对照组下降(抑制率为52.32%)。5.Western Blot检测感染LV-sh-Paip1慢病毒组(目的组)肝癌SMMC-7721细胞的PDCD4蛋白相对表达量,与阴性对照组及空白对照组相比有明显升高(P<0.01)。结论:1.Paip1蛋白表达水平在人肝癌细胞株HepG2,HepG2.2.15,SMMC-7721,Hep3B中较人肝细胞株L02明显高,说明Paip1可能在肝癌中高表达。2.利用RNAi干扰Paip1基因表达后,肝癌Hep G2细胞和SMMC-7721细胞迁移和增殖能力明显下降。3.沉默Paip1,肝癌细胞SMMC-7721的PDCD4蛋白相对表达量升高,而PDCD4目前被公认为在肝癌的发生发展过程中起抑制作用,初步验证了Paip1可能通过PDCD4发挥作用。