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肉毒毒素(botulinumtoxins,BoNTs)是肉毒梭状芽孢杆菌在厌氧条件下产生的一组外毒素蛋白,它可导致神经中毒症状,是目前已知的自然界中最毒的物质。BoNTs有七种血清型(A-G),各型均为双链蛋白分子(分子量150KD),由重链(HC-100KD)和轻链(LC-50KD)通过二硫键连接。轻链是催化功能结构域具有内肽酶的活性。重链由两个结构域组成;与膜转位相关的N端结构域(HN)和与神经细胞结构相关的C端结合域(Hc)。研究表明,BoNT/Hc包含保护性抗原基本决定簇作为免疫原能引发显著的保护性应答。肉毒毒素通过作用于神经细胞,抑制神经递质的释放,引起松弛性神经麻痹,肉毒中毒是一种致死率很高的疾病,自然状况下,A、B、E、F型肉毒毒素是引起人类中毒的主要类型。使用中和保护性抗血清治疗是目前治疗肉毒毒素中毒的最有效的手段。目前尚无能够有效保护BoNTs的中和保护性单克隆抗体用于临床治疗。因此研究抗BoNTs的中和保护性单克隆抗体及其识别表位和作用机制,对研制预防性疫苗、制备治疗性抗体具有重要意义。本论文旨在利用杂交瘤技术筛选获得具有中和活性的单克隆抗体。鉴定抗体的体内、外中和保护活性,通过噬菌体展示技术,淘选抗体识别的中和表位,进而分析BoNT/Hc结构上的功能结构域与抗体结合表位的关系。初步阐明抗体中和保护作用的机制,为治疗性肉毒毒素抗体的研发提理论基础和实验依据。研究主要包括以下几个部分:一、BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc的表达和纯化我们分别全基因合成了BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc DNA序列,并构建了大肠杆菌原核表达载体。成功地可溶性表达了BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc蛋白,并WB验证之。二、抗BoNTs单克隆抗体的筛选、鉴定和制备我们以表达纯化的bont/bhc蛋白作为免疫原,采用常规的杂交瘤技术制备了分泌结合bont/bhc抗体的16株杂交瘤细胞株,经初步筛选和鉴定获得3株结合在bont/bhc不同功能区域且具中和保护活性的抗体(2f4、5g10、8e10、),其中8e10抗体具有型交叉结合活性。并对它们亚型及亲和力进行了测定。三、3株抗体体内中和保护活性检测采用经典的小鼠体内攻毒保护实验,检测了3株抗体的bont/b中和保护活性,抗体中和保护活性的检测结果表明,3株抗体都能完全中和保护10倍ld50sbont/b的攻击,40倍ld50bont/b的攻毒击时,2f4和5g10抗体能完全保护小鼠,无一死亡;8e10抗体也能延长小鼠生存时间达72h左右。而且8e10对bont/a、bont/e、bont/f还有较强的交叉中和保护活性。四、抗体表位的淘选、鉴定及其保护机制的研究为了分析2f4、5g10和8e10抗体所识别的中和表位,首先采用噬菌体随机12肽库对这三株抗体所识别的表位分别进行淘选,获得它们识别的表位序列。然后,通过合成表位肽的竞争性elisa实验鉴定抗体识别表位。序列比对结果表明:3株抗体所识别的表位序列均位于bont/bhc的受体结合区域:2f4识别表位1114kxsp1117和5g10识别的表位1201sdxfy1205均与bont/bhc的蛋白受体结合域部分重叠,但两表位完全不重叠;8e10所识别的表位1259sxwy1262位于bonts保守的gt1b受体结合域(h…sxwy…g)内。wb和elisa实验结果也证实8e10交叉结合四种毒素hc蛋白。五、不同识别表位的抗体间的协同作用及其机制研究为了研究这三株识别的表位不重叠的抗体是否具有保护协同作用,我们分别检测单株抗体和不同株抗体间组合的体内中和保护效果,对比发现结合在gt1b受体结合位点上的8e10抗体,与分别结合sytii的结合位点上不重叠抗原表位的抗体5g10或2f4组合有协同作用,然而,尽管5g10和2f4分别结合sytii结合的区域不重叠的位点,但两者组合没有协同作用。8e10的结合表位在bont/a,b,e和f中是高度保守的。它可以交叉保护不同血清型的bonts攻击。因此,这株抗体有望成为一个与结合在其他毒素功能结构域的抗体一起有协同保护作用的通用的伙伴抗体。总之,本研究经筛选、鉴定获得了3株具有中和保护活性的单克隆抗体(8E10、5G10、2F4),采用噬菌体随机12肽库对这三株抗体所识别的抗原表位进行淘选,获得其识别的表位序列。研究了具有中和保护活性的抗体识别的表位及其机制,并探讨了8E10抗体的交叉保护机制,揭示了识别不同表位的抗体的协同效应机制。为肉毒中毒的预防和治疗性抗体的研制及应用提供了理论基础和设计依据。