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L-苏氨酸是猪饲料中继L-赖氨酸之后的第二限制氨基酸,是家禽饲料中继L-甲硫氨酸和L-赖氨酸之后的第三限制性氨基酸,可以改善机体的免疫功能与脂肪代谢,还可以促进生长、改善肉质、促进小肠黏液蛋白分泌、维持肠道健康等,具有重要的生理功能。除此之外,L-苏氨酸也被广泛应用于食品、医药和化妆品等很多领域。目前,L-苏氨酸工业上主要通过大肠杆菌（Escherichia coli）发酵法生产,且是年产量排名第三的氨基酸,仅次于L-谷氨酸和L-赖氨酸。虽然工业发酵中所使用的大肠杆菌产L-苏氨酸的水平很高,但与理论糖酸转化率（81%）还有一定的差距,所以进一步提高大肠杆菌生产L-苏氨酸的能力,并且开发一些新的基因工程手段具有重要意义。本论文以高产L-苏氨酸大肠杆菌菌株TWF001为主要研究对象,开发了新型无抗表达载体系统和动态调控原件,并利用这些手段显著提高了TWF001的L-苏氨酸产量。主要研究结果如下:（1）对大肠杆菌TWF001在摇瓶发酵和分批补料发酵罐发酵条件下的生长状况和氨基酸产量进行了全面分析。TWF001的生长速度明显低于大肠杆菌K-12 W3110。在摇瓶发酵中显示,TWF001可以在不影响其他氨基酸代谢的情况下,具有较强的生产L-苏氨酸的能力。在分批补料发酵中,TWF001的L-苏氨酸产量在23 h内达到30.35g/L,生产强度为1.32 g/L/h,主要氨基酸副产物为L-甘氨酸（0.22 g/L）和L-丙氨酸（0.46 g/L）。（2）利用比较转录组学对TWF001在对数期（菌株生长时期）和稳定期（L-苏氨酸生产时期）胞内全基因组的转录水平进行系统分析,解析其L-苏氨酸高产机制。全基因组转录分析结果显示:以W3110为对照,对数期1739个基因（249个上调,1490个下调）和稳定期2361个基因（319个上调,2042个下调）的转录水平发生了显著变化。结合代谢通路分析显示:与L-苏氨酸生物合成相关的基因（aspC、thrABC和asd）显著上调。与NAD（P）H再生相关的基因（uxaB、tyrA、pntAB、wrbA、ndh和gabD）显著上调。TCA循环相关的基因（sucCD、sdhC、acnA、sucB、aceB、mdh、sdhACD）显著下调。L-苏氨酸降解的关键基因（tdh、tdcD、tdcE、tynA、mhpF、tdcB和pta）显著下调。L-苏氨酸输出基因rhtA上调,L-苏氨酸输入基因sstT和tdcC下调。gadA、gadB、dtu、glnA、gltD和gltB等多个上调的基因形成一个可为L-苏氨酸合成提供氨基供体的氨基供应环。多数编码核糖体30S和50S亚单位的基因显著上调。（3）构建了适用于TWF001的不需要添加抗生素即能稳定存在的质粒表达系统。为符合高效、环保、安全生产的国家和企业需求,构建了基于将脂多糖生物合成过程中的必需基因lpxA从染色体转移到表达载体的新型无抗表达系统,并利用此系统构建无需添加抗生素且系统中无抗生素抗性基因的大肠杆菌重组菌来提高L-苏氨酸合成。前期构建八个研究质粒用以检测质粒上回补lpxA基因中PAM的沉默突变对Cas9蛋白识别的影响,确定最佳方案,结果显示沉默突变PAM中至少两个位点才可以有效的避开被Cas9蛋白识别,并且沉默突变PAM的个数越多,整体系统敲除染色体上lpxA的效率越高。最终构建以质粒pCas9Cre、pTF-A-UD和pRSFCmlpxA为基础的新型大肠杆菌无抗表达系统。质粒pCas9Cre表达酶Cas9、λ-Red酶组和酶Cre,可在42℃下去除;pTF-A-UD含有敲除染色体lpxA所需的多个DNA片段,可通过添加IPTG去除;pRSFCmlpxA含有lpxA突变体lpxA123和可以添加IPTG去除的氯霉素抗性基因CamR。在野生型大肠杆菌MG1655和生产L-苏氨酸的大肠杆菌TWF006中应用结果显示,该系统可以很好的应用于过表达基因thrABC和rhtA来提高大肠杆菌L-苏氨酸生产,并且lxpA的过表达不会影响L-苏氨酸的合成。（4）利用基于苏氨酸调控的调控元件(抑制元件thrR和促进元件PcysH)在染色体上对多个关键基因进行动态调控,进一步提高L-苏氨酸产量。应用苏氨酸操纵子先导调控元件thrL调控基因arcA、cpxR、gadE、fadR和pykF的表达,发现重组菌株都较出发菌TWF001有更多的L-苏氨酸合成。在TWF001的iclR调节区插入thrL的不同部分,最终筛选得到菌株TWF063,其在初始葡萄糖浓度为40 g/L下培养30 h,可生产16.34g/L的L-苏氨酸,最终确定最优组合thrR的碱基序列。分别应用苏氨酸激活启动子PcysH、PcysJ和PcysD调控aspC基因的表达,并将其插入染色体上,最终确定PcysH为最佳启动子,从而进一步提高了TWF063的L-苏氨酸产量（培养30 h后,可产17.56 g/L L-苏氨酸的菌株TWF066）。以TWF066为出发菌株,累积调控arcA、cpxR、gadE、pykF和fadR基因的表达,获得生产L-苏氨酸的最佳菌株TWF083。（5）对构建的各种L-苏氨酸高产菌株进行发酵,发现TWF083菌株L-苏氨酸产率最高。对高产L-苏氨酸菌株TWF001、TWF058、TWF063、TWF066、TWF070、TWF077、TWF078和TWF083进行摇瓶发酵。发酵结果显示与其它7株高产菌株相比,TWF083具有的优势是:干重最大（30.87 g/L）,L-苏氨酸产量最高（26.95 g/L）,糖酸转化率最高（67.37%）,发酵液中乙酸浓度最低,丙酮酸和草酰乙酸在发酵中期浓度最高。对TWF001和TWF083进行不同葡萄糖浓度发酵显示,TWF083在各葡萄糖浓度下都具有高产L-苏氨酸的优势,最适葡萄糖初始浓度为40 g/L。TWF001和TWF083分批补料发酵显示,48 h发酵结束后TWF083菌株合成了116.62 g/L的L-苏氨酸,糖酸转化率为48.6%,生产强度为2.43 g/L/h,乙酸浓度（1.14 g/L）降低89%,丙酮酸（0.04 g/L）基本耗尽,NADPH（4.97 g/L）、乙酰辅酶A（0.21 g/L）还有剩余。