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丹参是我国常用的一味传统中药,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效,是治疗心脑血管疾病最常用的药物之一。丹参中主要含有两类活性成分:一类为脂溶性的二萜醌类化合物,如丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、二氢丹参酮(dihydrotanshinone)、隐丹参酮(cryptotanshinone)等;另一类为水溶性酚酸类化合物,如丹酚酸B(salvianolic acid B)、丹酚酸A(salvianolic acid A)、迷迭香酸(rosmarinic acid)、紫草酸(lithospermic acid)等。
丹酚酸类成分具有抗脂质过氧化、抑制血小板聚集、抗肝纤维化、抗血栓、改善肝肾功能等广泛的药理作用,是丹参治疗心脑血管疾病和肝肾疾病的重要物质基础,以丹酚酸为主要有效成分的药物开发越来越受到重视。采用现代生物技术工业化生产丹参中有效成分是解决丹参药用资源短缺和药物质量控制问题有效方法和手段。
本研究主要以丹参毛状根为研究对象,利用现代分离分析手段系统研究了丹参毛状根中的化学组成,并与丹参药材各个部位的化学组成进行了比较,结果表明丹参毛状根中酚酸类化合物含量较高,其化学组成与丹参叶片的化学组成相似,其中丹参毛状根中含量较高的丹酚酸K在丹参药材中含量很小。对丹参毛状根中含量较高的成分:丹酚酸K、迷迭香酸、丹酚酸B进行了分离和结构鉴定。对丹参毛状根中主要的四种酚酸类成分采用DPPH自由基清除法比较了其抗氧化活性,结果表明清除DPPH自由基的能力为:丹酚酸K＞迷迭香酸＞丹酚酸B＞丹参素钠。
系统研究了生物诱导子茉莉酸甲酯(MJ)对丹参毛状根中酚酸类化合物秋累的影响和丹酚酸次生代谢相关酶的影响,结果表明MJ对丹参毛状根的生长具有一定抑制作用,并能显著改变丹酚酸类成分在丹参毛状根中的积累,其中MJ浓度为300μmol·L-1,诱导培养15天的毛状根中丹参素含量达对照样品的2.85倍;MJ浓度为300 μmol·L-1,诱导培养10天的毛状根中迷迭香酸的含量达对照样2倍;MJ浓度为200 μmol·L-1,诱导培养30天的丹参毛状根中丹酚酸B的含量最高达对照的8.42倍。研究中发现,随着MJ诱导时间的不同,丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的含量呈现不同的变化,迷迭香酸的含量先快速增加,后逐渐减少.而丹酚酸B的含量则是逐渐累积递增。
采用半定量RT-PCR法研究了MJ对迷迭香酸生物合成途径酪氨酸支路的两个关键酶-酪氨酸氨基转移酶(TAT)和4-羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)的基因转录水平的影响,结果表明MJ能够显著提高这两个基因的转录水平,并且MJ诱导培养25天时,其转录水平达到最高值。研究同时发现,MJ诱导也能显著提高丹参毛状根中多酚氧化酶(PPO)的活性,并且MJ诱导时间越长,PPO的活性越高。
目前丹参中酚酸类化合物生物合成途径还未完全清楚,本研究以丹参毛状根为培养体系研究了MJ诱导子对丹酚酸类次生代谢产物及相关基因的影响,再结合其他相关分子生物学实验将为阐明丹酚酸类成分的代谢途径提供科学的依据。