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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是院内感染常见致病菌,尤易引起院内获得性肺炎,感染进展快,易耐药,病死率高。传统的细菌培养及相关生化鉴定是诊断细菌感染的金标准,但由于培养时间较长,且易受抗生素使用、接种时间及方法的影响,假阴性率高,难以满足临床早期诊断的要求。荧光实时定量聚合酶链反应(Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction FQ-PCR)操作简单快速,污染少,灵敏度及特异性高,可同步定量检测血中微量病原菌或其基因片段,能满足临床快速、准确检测病原菌的要求。有助于临床早期诊断,合理治疗。铜绿假单胞菌编码外膜蛋白基因(majorouter membrane lipoprotein I oprI)具有高度保守性,可作为FQ-PCR检测的目的基因。本研究试图通过oprI基因FQ-PCR检测快速准确诊断铜绿假单胞菌感染。第一章荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌方法建立目的建立FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的方法,来定量检测铜绿假单胞菌菌量,并与传统细菌培养相比检测灵敏度和特异性。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌(E.coliCompetent Cells)中。用氨苄青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因的质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌等非铜绿假单胞菌及阴性对照无扩增。在各类菌株的鉴定检测实验中,31株单纯铜绿假单胞菌全部为阳性,标准株ATCC 27853按等级浓度稀释后其拷贝数也呈等级梯度递减,实际可检测到的最小菌落数为100个/ml,灵敏度高,把铜绿假单菌与其它革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及白色念珠菌的混合后检测均为阳性结果。非铜绿假单胞细菌、白色念珠菌、乙肝病毒及巨细胞病毒以及肺炎支原体FQ-PCR检测鉴定均为阴性,特异性高。重复性好,批内CV值为0.95%,批间CV值为3.04%,全程检测不到4小时,简单快速。结论成功建立FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的方法,可快速准确地检测铜绿假单胞菌菌量。第二章荧光定量PCR在铜绿假单胞菌败血症模型中运用的研究目的探讨FQ-PCR定量检测铜绿假单胞菌oprI基因的方法在抗生素治疗前后快速诊断铜绿假单胞菌败血症中的作用。方法①制备1×10~9CFU/ml、1×10~8CFU/ml、1×10~7CFU/ml、1×10~6CFU/ml及1×10~5CFU/ml五个不同浓度的标准菌株铜绿假单胞菌。并对标准菌株铜绿假单胞菌行药敏实验,找出敏感药物(丁胺卡那霉素)及非敏感药(苯唑青霉素)。②SD大鼠120只随机分为5组,每组各24只,分别取所制备的不同浓度的菌液按0.5ml/100g尾静脉注入实验对象,于实验开始0h、12h、24h、48h各组分别麻醉6只大鼠,采血2ml作血培养,1ml提取DNA作荧光实时定量PCR检测。③SD大鼠72只随机分为治疗组、处理组和对照组各24只,均给予1×10~9CFU/ml 0.5ml/100g尾静脉注入。随后治疗组立即给予敏感抗生素;处理组立即给予非敏感抗生素;对照组同时给予等量生理盐水,均于尾静脉注入。各组于首次注射后0h、12h、24h、48h分别麻醉6只大鼠,采血2ml作血培养,1ml提取DNA(全血基因组DNA提取试剂盒)作荧光实时定量PCR检测。结果①1×10~9CFU/ml、1×10~8CFU/ml组各时间段血培养均为阳性,FQ-PCR检测0h Ct值为23.23±1.52～26.75±1.72,拷贝数约为10~5～10~4 copies/μl,随着时间推移Ct值逐渐上升(拷贝数下降),One-way ANOVA分析显示不同时间点之间两两比较经统计学处理差异有显著性(两组F值分别为140.69,162.30 P均＜0.01),48h达高峰为33.15±1.17～37.75±0.97,拷贝数约为10~2～10~1copies/μl,均为阳性。②1×10~7CFU/ml、1×10~6CFU/ml组0h、12h血培养均为阳性,1×10~7CFU/ml组24h血培养为阳性,48h为阴性,而1×10~6CFU/ml组24h、48h血培养均为阴性。FQ-PCR检测0h时Ct值为30.49±1.34～33.45±0.85,拷贝数约为10~3～10~2copies/μl,随着时间推移Ct值上升,拷贝数下降,1×10~7CFU/ml组24h时Ct值为39.77±1.47,拷贝数约为10~0 copies/μl,为阳性,48h时Ct值＞45,为阴性。1×10~6CFU/ml组24h、48h时的Ct值均＞45,为阴性。③1×10~5CFU/ml组各时间段血培养均为阴性,FQ-PCR检测0h拷贝数＞45,均为阴性。④处理后对照组、处理组各时间段血培养均为阳性,而处理后治疗组各时间段血培养均为阴性。FQ-PCR检测对照组、处理组、治疗组0h Ct值分别为23.30±1.49,23.71±1.31,23.69±1.54,三组两两比较经统计学处理差异无显著性;12h Ct值分别为27.57±1.35,28.05±0.97,30.56±1.74;24h Ct值分别为30.21±1.33,30.87±1.42,36.35±1.51;48h Ct值为33.43±1.28,33.29±1.74,39.73±1.09。处理后12h、24h、48h对照组、处理组两组间的Ct值比较经统计学处理差异无显著性(P＞0.05);而处理后12h、24h、48h治疗组与对照组、处理组相比较经统计学处理差异有显著性(P均＜0.01),但仍为阳性。结论①利用FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因来诊断铜绿假单胞菌败血症与传统细菌培养比较其特异性吻合率达100%,虽灵敏度并未增加,但诊断时间明显缩短。②有效抗生素治疗后,运用FQ-PCR诊断铜绿假单胞菌败血症的灵敏度明显高于传统细菌培养。③利用FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的拷贝数的变化可能有助于抗生素体内敏感性的判断。