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目的:胰腺癌是一种常见的难以诊断和治疗的恶性肿瘤。近年来因胰腺癌引起的发病率明显上升,其预后效果极差。所以研究胰腺癌的相关分子机制有助于在临床上针对潜在的治疗靶点进行用药。BAG3是人类共分子伴侣BAG家族(BAG1-6)中的一员,它对细胞存活、自噬、细胞骨架排列以及一些病毒的复制等过程都有影响。BAG3在各种癌症中均呈现高表达,其表达与胰腺癌、胶质母细胞瘤和甲状腺癌等癌症的不良预后有关。干扰素刺激基因ISG15在细胞内以游离型和与蛋白结合的两种形式存在,在多种原发性人类癌症(包括胰腺腺癌和消化系统恶性肿瘤)中常呈现高表达状态。已有报道发现细胞内的ISG15具有促肝癌细胞增殖和迁移等促肿瘤的功能。然而,细胞外ISG15是肿瘤启动子还是肿瘤抑制因子尚未明确。在胰腺导管腺癌中,肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)分泌的ISG15蛋白可增强肿瘤干细胞表型。而在乳腺癌中,细胞外游离的ISG15会引起抗肿瘤免疫应答,抑制乳腺癌的生长。在本课题的前期研究中我们发现,BAG3敲低时ISG15的蛋白表达水平发生下调,而ISG15的mRNA水平发生上调。我们还发现BAG3并不能使ISG15的mRNA富集。BAG3和ISG15的敲低都会抑制干细胞样表型。综上,我们在前期的实验基础上继续探索BAG3与ISG15的具体机制以及BAG3和ISG15对胰腺癌的肿瘤干细胞样表型的影响,为胰腺癌的治疗提供新的治疗靶点。研究方法:1、构建BAG3、ISG15稳定表达的胰腺癌细胞株。2、使用RT-PCR技术检测ISG15和BAG3的mRNA的表达水平。3、使用Western blot技术检测目的基因的蛋白水平的变化。4、邻位连接技术PLA技术检测BAG3与ISG15是否相互作用。5、通过克隆形成实验检测BAG3或ISG15敲低时胰腺癌细胞的克隆形成能力。6、使用Actinomycin D按时间梯度处理细胞检测目的基因mRNA稳定性。7、使用试剂盒获取胰腺癌细胞中新生的mRNA。8、通过球囊形成实验检测BAG3或ISG15敲低时胰腺癌细胞的球囊形成能力。9、使用RNA结合蛋白免疫沉淀技术检测BAG3与ISG15的mRNA的相互作用。10、使用Transwell实验检测BAG3或ISG15敲低时胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。11、使用Dot Blot实验检测BAG3敲低的胰腺癌细胞中ISG15向胞外分泌水平。12、通过裸鼠成瘤实验检测BAG3敲低对肿瘤形成的影响。结果:1、BAG3在胰腺癌细胞系中正向调控ISG15的表达;2、在胰腺癌细胞系中敲低BAG3使ISG15 mRNA稳定但抑制其进行翻译;3、在胰腺癌细胞系中BAG3敲低通过Ago2调控ISG15的表达;4、BAG3敲低抑制胰腺癌细胞系干细胞样表型;5、敲低ISG15抑制胰腺癌细胞系干细胞样表型;6、过表达ISG15恢复BAG3敲低对胰腺癌细胞系干细胞样表型的抑制作用。结论:在胰腺癌细胞中,BAG3正向调控ISG15的表达,BAG3敲低通过Ago2对ISG15的翻译水平进行调控从而抑制胰腺导管腺癌干细胞样表型。