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目的:观察温阳益气方对缺氧-葡萄糖剥夺(OGD)诱导H9c2细胞自噬的干预作用,探讨其调控自噬对抗心力衰竭的作用机制。
方法:
1制备OGD诱导的H9c2细胞自噬模型,确定模型成立的干预条件。
2各实验对照组(等体积完全培养基)在普通培养箱中培养,雷帕霉素组和温阳益气方组分别在给予含药培养基干预24h后,与模型组一样更换为等体积无血清无糖培养基,移至缺氧培养箱中培养6h。
3CCK-8分析梯度浓度温阳益气方对H9c2细胞活性的影响,流式细胞术检测H9c2细胞凋亡,qRT-PCR法检测H9c2细胞Beclin-1和LC3表达水平,透射电镜观察自噬体形成,Westernblot检测H9c2细胞Beclin-1、LC3-II/LC3-I、p62表达水平和mTOR通路激活情况。
结果:
1OGD诱导H9c2细胞自噬实验中,与OGD0h比较,OGD6hBeclin-1、LC3mRNA和Beclin-1蛋白、LC3-II/LC3-I表达最大增加,p62活性随之减少,差异有统计学意义(P<0.01)。
2CCK-8分析梯度浓度温阳益气方对H9c2细胞活性影响实验中,3.2、6.4mg/ml温阳益气方预处理12h和24h,细胞活性均降低,且6.4mg/ml组预处理12h和24h与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);膜联蛋白V-FITC/PI染色实验中,与OGD组比较,温阳益气方组H9c2细胞凋亡明显减少,且不同剂量干预组间抗凋亡作用比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
3qRT-PCR检测H9c2细胞Beclin-1、LC3表达实验中,与OGD组比较,温阳益气方组Beclin-1、LC3表达明显降低,且不同剂量干预组间比较有差异,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);WesternBlot检测H9c2细胞Beclin-1、LC3-II/LC3-I和p62表达实验中,与OGD组比较,温阳益气方组Beclin-1、LC3-II/LC3-I表达降低,p62表达增加,且不同剂量干预组间比较有差异,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
4透射电镜观察H9c2细胞自噬体形成实验中,与OGD组和OGD+雷帕霉素组比较,温阳益气方干预组可显著减少自噬体形成;qRT-PCR检测H9c2细胞Beclin-1、LC3表达实验中,与OGD组和OGD+雷帕霉素组比较,温阳益气方干预组Beclin-1、LC3表达明显降低,有统计学意义(P<0.01);WesternBlot检测H9c2细胞p-mTOR、mTOR、Beclin-1、LC3-II/LC3-I和p62表达实验中,与OGD组和OGD+雷帕霉素组比较,温阳益气方干预组Beclin-1、LC3-II/LC3-I表达降低,p62表达升高,OGD+温阳益气方组p-mTOR/mTOR比率增加,有统计学意义(P<0.01),OGD+雷帕霉素+温阳益气方组p-mTOR/mTOR比率却无明显改变(P>0.05)。
结论:
1温阳益气方可显著逆转OGD诱导H9c2细胞的自噬活性和p62表达,并可显著抑制OGD诱导的细胞凋亡,具有剂量依赖性。
2温阳益气方通过介导mTOR通路发挥抑制自噬作用。
方法:
1制备OGD诱导的H9c2细胞自噬模型,确定模型成立的干预条件。
2各实验对照组(等体积完全培养基)在普通培养箱中培养,雷帕霉素组和温阳益气方组分别在给予含药培养基干预24h后,与模型组一样更换为等体积无血清无糖培养基,移至缺氧培养箱中培养6h。
3CCK-8分析梯度浓度温阳益气方对H9c2细胞活性的影响,流式细胞术检测H9c2细胞凋亡,qRT-PCR法检测H9c2细胞Beclin-1和LC3表达水平,透射电镜观察自噬体形成,Westernblot检测H9c2细胞Beclin-1、LC3-II/LC3-I、p62表达水平和mTOR通路激活情况。
结果:
1OGD诱导H9c2细胞自噬实验中,与OGD0h比较,OGD6hBeclin-1、LC3mRNA和Beclin-1蛋白、LC3-II/LC3-I表达最大增加,p62活性随之减少,差异有统计学意义(P<0.01)。
2CCK-8分析梯度浓度温阳益气方对H9c2细胞活性影响实验中,3.2、6.4mg/ml温阳益气方预处理12h和24h,细胞活性均降低,且6.4mg/ml组预处理12h和24h与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);膜联蛋白V-FITC/PI染色实验中,与OGD组比较,温阳益气方组H9c2细胞凋亡明显减少,且不同剂量干预组间抗凋亡作用比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
3qRT-PCR检测H9c2细胞Beclin-1、LC3表达实验中,与OGD组比较,温阳益气方组Beclin-1、LC3表达明显降低,且不同剂量干预组间比较有差异,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);WesternBlot检测H9c2细胞Beclin-1、LC3-II/LC3-I和p62表达实验中,与OGD组比较,温阳益气方组Beclin-1、LC3-II/LC3-I表达降低,p62表达增加,且不同剂量干预组间比较有差异,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
4透射电镜观察H9c2细胞自噬体形成实验中,与OGD组和OGD+雷帕霉素组比较,温阳益气方干预组可显著减少自噬体形成;qRT-PCR检测H9c2细胞Beclin-1、LC3表达实验中,与OGD组和OGD+雷帕霉素组比较,温阳益气方干预组Beclin-1、LC3表达明显降低,有统计学意义(P<0.01);WesternBlot检测H9c2细胞p-mTOR、mTOR、Beclin-1、LC3-II/LC3-I和p62表达实验中,与OGD组和OGD+雷帕霉素组比较,温阳益气方干预组Beclin-1、LC3-II/LC3-I表达降低,p62表达升高,OGD+温阳益气方组p-mTOR/mTOR比率增加,有统计学意义(P<0.01),OGD+雷帕霉素+温阳益气方组p-mTOR/mTOR比率却无明显改变(P>0.05)。
结论:
1温阳益气方可显著逆转OGD诱导H9c2细胞的自噬活性和p62表达,并可显著抑制OGD诱导的细胞凋亡,具有剂量依赖性。
2温阳益气方通过介导mTOR通路发挥抑制自噬作用。