研究背景： 鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一,其发生发展与许多因素有关。目前,其5年生存率为50％～60％,因此,为改善其生存率,许多新的治疗NPC模式被提出。近年来,随着对NPC等多种肿瘤发病机制及细胞生长调控机理研究的深入,许多研究者提出将基因治疗加入到与传统抗癌治疗当中,希望获得协同抗癌作用,从而提高NPC的生存率,其中靶向肿瘤血管自杀基因治疗是较有前景的一种方式。 已有研究表明VEGF及VEGFR在NPC组织中高表达,且与NPC肿瘤血管的形成呈正相关。体内、外实验均已证实VEGFR-2(KDR)启动子调控的自杀基因可在NPC血管内皮细胞内表达并具有靶向杀伤NPC血管的能力。因此,靶向NPC微血管内皮细胞自杀基因系统治疗后,其对NPC的局控率和生存率是否有影响,值得探讨。 研究目的： 将由腺病毒载体介导的、KDR基因启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达的自杀基因系统转入荷瘤裸鼠的人NPC移植瘤内,同时联合60Coγ射线肿瘤局部外照射,了解其对肿瘤及VEGFR表达的影响,从而评价外照射和AdKDR-tk/GCV自杀基因系统对NPC是否具有协同杀伤作用,为NPC的临床治疗提供新思路和方法。 材料和方法： 1 细胞培养 1.1 细胞株人鼻咽癌CNE-2细胞株。 1.2 实验材料 1.3 实验方法将CNE-2人鼻咽低分化鳞癌细胞株置于10％小牛血清的RPMI-1640培养基培养,并于培养液中加入青霉素100U/ml,链霉素100mg/ml。传代一周,待细胞长成满瓶时,用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化后,制成每毫升含5×106个细胞悬液。 2 重组腺病毒构建 2.1 实验材料 pBluescriptIIKDR-tk、穿梭质粒ptrack、腺病毒质粒pAdEasy-1及胚胎肾细胞系293细胞等。 2.2 实验方法采用pAdeasy系统,按定向克隆方法将KDR-tk片段正向插入表达载体的多克隆位点间,构建受KDR启动子调控并可表达HSV-tk基因的pAdKDR-tk,在293细胞中包装、扩增。 3 裸鼠鼻咽癌移植瘤模型的建立 3.1 实验动物 BALB/C近交系裸鼠32只,雌雄各半,4-6周龄,体重15-20克。 3.2 实验材料 1ml医用注射器和裸鼠饲养房等。 3.3 实验方法将含1×106个CNE-2细胞的悬液注射到裸鼠背侧右后肢上部皮下后,于中山大学动物实验中心二级以上动物实验室饲养,并定期观察记录移植瘤生长情况。 4 动物分组和治疗 4.1 实验材料 4.2 实验方法 4.2.1 动物分组 CNE-2细胞接种结束后第14天时,全部成瘤,大小约200mm3,将裸鼠随机分为4组,每组8只,分别为自杀基因联合放射治疗组、放射治疗组、自杀基因治疗组和空白对照组。 4.2.2 治疗分别对Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组裸鼠瘤体内进行多点注射重组腺病毒液共0.2ml,此后24小时和第7天各重复注射一次重组腺病毒液。第二次注射病毒液时,同时向Ⅰ、Ⅲ组小鼠腹腔注射GCV 100 mg/kg,Ⅱ、Ⅳ组小鼠腹腔注射PBS100mg/kg,每日一次,连续14天。其中Ⅰ、Ⅱ组小鼠分别于腹腔注射GCV和PBS后12小时以水合氯醛300mg/kg腹腔内注射,麻醉后施行60Co γ射线局部外照射裸鼠移植瘤,225伦琴/分钟,2Gy/次,隔日外照射一次,共7次,外照射总剂量14Gy。 4.2.3 动态观察记录裸鼠移植瘤生长大小治疗前1天及治疗开始后的第3天,第6天,第9天,第12天,第15天,第18天及第21天测量瘤体垂直长径和短径,绘制瘤体生长曲线。 4.2.4 处死裸鼠、剥离肿瘤并测量实体瘤质量治疗结束后第8天处死裸鼠,剥离瘤块并称重,计算各组的肿瘤质量抑制率。 4.2.5 取材、收集标本肿瘤称重结束后将其浸泡于4％多聚甲醛中固定,保存标本备用。 5 常规病理学检查 5.1 实验材料 5.2 实验方法采用切片、脱蜡、苏木素、伊红染色及脱水步骤。 6 免疫组化染色 6.1 实验材料 FLK-1、FLT-1mice antibody,迈新即用型免疫组化试剂盒S-P kit,KIT9720、PBS、18cm不锈钢高压锅和电炉、医用微波炉、水浴箱、冰箱、湿盒、耐高温塑料切片架、可调微量移液器、定时器、pH计等。 6.2 实验方法 6.2.1 免疫组化步骤采用切片、脱蜡、抗原修复、滴加一抗、二抗及亲合素-过氧化酶复合物和复染苏木素步骤。 6.2.2 免疫组化结果判定 6.2.2.1 VEGFR-2,VEGFR-1表达于肿瘤细胞及血管内皮细胞浆及细胞膜,染色呈黄色、棕色及黄褐色。 6.2.2.2 以日本Olympus u-SPT摄像头显微镜采图,并以HPIAS-1000PD(高清晰度图文报告分析系统)对其阳性细胞平均灰度值进行测量分析,以确定其表达的强弱。染色越淡,平均灰度值越高,表达越弱。 7 统计学方法实验结果采用SPSS 11.5统计学软件,瘤体体积、质量及VEGFR2,VEGFR1表达均以x±S表示,组间均数比较采用方差检验及秩和检验进行分析。 结果： 1 pBluescript Ⅱ KDR-tk鉴定经XhoⅠ/Sal1酶切后,显示为两条片段,分别为2.2kb和2.96kb,大小及测序结果与提供资料相符。 2 重组腺病毒质粒pAdKDR-tk鉴定重组pAdKDR-tk经PacⅠ酶切,显示的2个片段大小与预期值一致。 3 重组腺病毒的产生及滴度测定重组腺病毒质粒转染293细胞后,荧光显微镜下可见细胞有GFP表达。经3次293细胞内的扩增、CsCl梯度离心后,测定病毒滴度为1×1010pfu/ml。 4 重组腺病毒的鉴定PCR分析外源基因的整合按标准方法抽提病毒基因组DNA,取1μl进行PCR,结果表明病毒载体介导tk基因整合至重组腺病毒基因组中。 RT-PCR分析外源基因的表达采用TRIzol试剂盒,抽提293细胞总RNA,进行RT-PCP反应,可见扩增的片段,表明tk基因在mRNA水平上能有效的表达。 5 裸鼠人NPC移植瘤生长曲线癌细胞系接种在BALB/C裸鼠两周全部成瘤。治疗前各组肿瘤体积差异无统计学意义;经治疗后第3天起小鼠瘤体体积发生变化,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组裸鼠移植瘤体积小于Ⅳ组裸鼠肿瘤体积,差异具有统计学意义;第1～6天,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组间裸鼠肿瘤大小无显著差异性;从第9天起,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组间肿瘤体积大小由大到小依次为Ⅲ组、Ⅱ组和Ⅰ组,差异具有统计学意义。 与Ⅳ组相比,Ⅱ、Ⅲ组裸鼠肿瘤生长明显受抑,治疗后第21天的肿瘤平均体积分别为Ⅳ组的28.2％和39.4％。Ⅰ组裸鼠肿瘤生长受到抑制更加显著,第21天肿瘤平均体积只有Ⅳ组的13.5％,明显低于Ⅱ、Ⅲ组,差异具有统计学意义。 6 肿瘤质量抑制率结果显示Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的肿瘤质量小于Ⅳ组肿瘤质量,差异均有统计学意义,且Ⅰ组的肿瘤质量抑制率为84.39％,高于Ⅱ、Ⅲ组的70.88％和58.43％,差异具有统计学意义,Ⅱ组肿瘤质量抑制率高于Ⅲ组,差异亦具有统计学意义,初步实验证实：联合治疗组明显优于单纯放疗或自杀基因治疗组。 7 常规病理检查结果空白对照组癌细胞体积大,呈圆形、卵圆形或不规则形,胞浆界限不清,细胞呈团块状或片巢状不规则排列,可见泡状核,部分细胞见明显核仁。放射治疗联合自杀基因治疗组NPC细胞数目较单一放疗组、单纯自杀基因治疗组和空白对照组NPC细胞数目减少,癌细胞呈退行性变,见大量核碎裂。 8 免疫组化各组VEGFR-2,VEGFR-1表达情况VEGFR-2,VEGFR-1表达于肿瘤细胞及血管内皮细胞细胞浆或细胞膜,呈淡黄色、棕黄色、黄褐色颗粒。判断标准：以日本01ympus u-SPT摄像头显微镜采图,在高倍显微镜下(400倍)观察细胞着色,每个切片随机选择3个视野,并以HPIAS-1000PD(高清晰度图文报告分析系统)对其阳性细胞区域灰度值进行测量,染色越淡,平均灰度值越高,表达越弱,检测相同面积内阳性着色颗粒平均灰度值,取三者的平均值,对所取得的计量资料进行统计学分析。统计结果显示:VEGFR-2,VEGFR-1表达在四组小鼠间不同,VEGFR-2和VEGFR-1地各组的平均灰度值,各组肿瘤细胞的VEGFR-2,VEGFR-1表达强度由多到少依次为Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ组,差异具有统计学意义,提示自杀基因治疗组联合放射治疗在降低肿瘤细胞及血管上皮细胞的VEGFR-2,VEGFR-1表达方面优于各单纯治疗组及对照组。 结论： 1.利用腺病毒载体转染HSV-tk基因治疗BALB/C近交系荷人NPC裸鼠可明显抑制瘤体生长,治疗后肿瘤质量抑制率高。 2.靶向肿瘤血管的自杀基因系统联合化疗治疗BALB/C近交系荷人NPC裸鼠较单一放疗或自杀基因治疗方案有显著的提高,差异有统计学意义。 3.各组间的VEGFR-2,VEGFR-1表达明显不同,其表达差异具有统计学意义,放疗联合靶向肿瘤血管自杀基因治疗明显降低VEGFR-2,VEGFR-1表达,本研究为进-步开展靶向肿瘤血管内皮细胞自杀基因联合放射治疗NPC奠定了基础。