一、生物信息学方法研究高脂饮食诱导性肥胖对雄性SD大鼠新陈代谢的影响目的:应用生物信息学方法探寻高脂饮食诱导性肥胖雄性SD大鼠生理代谢改变,及肥胖对下丘脑-垂体-睾丸性腺轴可能造成的影响和途径。方法:利用NCBI中的GEO基因芯片公共数据库进行芯片数据搜索,搜索关键词为大鼠(rat),肥胖(obesity),脂肪组织(adipose tissue),最终选择芯片数据(GSE8700)作为分析对象。使用bioconductor包中R工具的函数及Limma程序包识别差异性表达基因(Differentlyexpressedgenes,DEGs),应用DAVID数据库对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,选用String在线数据库构建差异表达基因的PPI网络。结果:通过对GSE8700进行分析,得到1014个表达差异基因,其中上调基因544个,下调基因470个。上调差异基因GO条目全部富集于生物过程(BP),主要为氧化还原、轴突生成、对肽类激素反应、对糖皮质激素反应过程。下调差异基因GO富集于生物过程(BP),主要为女性怀孕、对有机物质的反应、蛋白质水解、对类固醇激素的反应、甘油三醋代谢等过程;富集于细胞组成(CC),主要为细胞外间质,细胞质,血液微球等组成;富集于分子功能(MF),主要为丝氨酸肽链内切酶活性、脂肪酸结合、磷脂质结合等功能。上调差异基因并未富集到任何KEGG通路,而下调差异基因富集到3条通路,分别为PPAR信号通路(过氧化物酶体增殖物激活型受体)、脂肪的消化和吸收通路、胰腺分泌通路。重要的节点基因为热休克蛋白90ABl(Hsp90ab1),细胞外钙敏感受体(Casr),趋化因子9(Cc19),受体相互作用蛋白激酶4(Ripk4),二甲基甘氨酸脱氢酶(Dmgdh),脂肪酸结合蛋白l(Fabpl),景天庚酮糖激酶(Shpk),载脂蛋白H(Apoh),胆囊收缩素受体(Cckar),谷氨酸代谢受体3(Grm3)等。结论:高脂饮食诱导性肥胖状态下,机体营养物质的新陈代谢发生了改变,尤其是脂质代谢发生了紊乱,这是肥胖的重要特点之一。GO和KEGG结果提示肥胖状态下机体生殖功能可能受到影响,类固醇激素、肽类激素代谢异常可能是其影响途径。二、高脂饮食诱导性肥胖对雄性SD大鼠的神经-生殖内分泌代谢及生精功能的影响目的:研究肥胖对机体神经-生殖内分泌代谢和生精功能的影响,并探讨上述影响产生的机制。方法:6周龄SPF级雄性SD大鼠45只,随机分为普通对照组15只、高脂饮食组30只,分别给予普通饲料、高脂饲料喂养16周,最后得到对照组大鼠15只、肥胖组大鼠22只。麻醉后处死,测定大鼠体重、身长、内脏脂肪、双侧肾脏、双侧睾丸的重量,并计算Lee指数、脂肪系数、肾脏系数、睾丸系数。腹主动脉取血,使用放射免疫法测定:Leptin、GLU、LH、FSH、T、E2,使用酶联免疫法测定:GnRH、GnIH、SHBG、TC、TG,并根据相关公式计算 GnRH/GnIH、E2/T、cFT、FTI。将大鼠左侧睾丸固定制作石蜡切片,HE染色观察生精小管组织学改变并记Johnsen评分,Tunel法测定睾丸组织生精细胞凋亡率。将大鼠右侧睾丸于冰上匀浆,测定睾丸组织的SOD活力及MDA含量。制作附睾尾部精子悬液,使用汉密尔顿计数仪测定精子数、活力、前向运动精子百分比。结果:在22周末,高脂饮食肥胖组大鼠(N=22)较对照组大鼠(N=15)体重明显升高[(552.93±7.76)gvs(622.91±7.26)g],差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,肥胖组大鼠Lee指数、脂肪系数、血清Leptin、INS、TG明显增高(P<0.05),而肾脏系数、睾丸系数明显降低(P<0.05)。与对照组比较,肥胖组大鼠GnRH、GnRH/GnIH比值、LH、TT、SHBG、FTI、cFT明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),E2、E2/T比值明显升高(P<0.05)。与对照组比较,肥胖组大鼠睾丸组织HE染色显示睾丸生精小管未见明显萎缩,但生精小管常见“空泡样”改变,且生精细胞排列偶见紊乱、层次减少,其睾丸组织Jhosen评分较对照组未见明显降低(P>0.05)。与对照组相比,肥胖组大鼠睾丸生精细胞TUNEL法显示凋亡增加,凋亡指数计数[(3.09±0.28)vs(4.26±0.35)%]降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,肥胖组大鼠睾丸组织匀浆液SOD活力[(62.57±4.64)vs(47.20±3.05)U/mgprot]降低,MDA 浓度[(2.94±0.443)vs(4.18±0.38)nmol/mgprot]升高,差异有统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,肥胖组大鼠附睾精子数目[(30.07±2.72)×106/ml vs(24.64±1.53)×106/ml],差异无统计学意义(P>0.05);精子活力[(36.40±9.17)%vs(14.36±7.67)%],差异有明显统计学意义(P<0.05);前向运动精子百分比明显下降[(12.80±3.05)%vs(5.27±3.14)%],差异有明显统计学意义(P<0.05)。结论:高脂饮食诱导的肥胖大鼠出现了体重增加、脂肪堆积、瘦素抵抗、胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱等代谢改变。高脂饮食诱导性肥胖SD雄性大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴代谢活动发挥了抑制作用,表现为血清GnRH、LH、T、cFT、SHBG明显降低,而E2明显升高。高脂饮食诱导的肥胖可能对睾丸组织以功能性损害为主,短时间内对生精小管组织形态的器质性改变较小,但长期来看可能会对其生精小管组织形态结构上造成损害。高脂饮食诱导的营养性肥胖大鼠睾丸组织生精细胞凋亡指数增加,并氧化应激水平提高,最终导致精子活力下降。三、高脂饮食诱导性肥胖导致雄性SD大鼠的下丘脑Kisspeptin-GnRH系统代谢下调目的:研究肥胖对下丘脑生殖调控中枢的影响及可能调控机制。方法:通过高脂饮食诱导建立肥胖大鼠模型,将对照组(N=18)和肥胖组(N=18)大鼠麻醉后,进行下丘脑取材。采用免疫组化染色法测定下丘脑中LepR、Kisspeptin、KisslR、GnRH 和 GnIH 的定位和表达变化;Westem-Blot 法检测 LepR、Kisspeptin、Kiss1R、GnRH、GnIH 的蛋白表达变化;Real-timePCR 法检测 LepR、Kiss1、Kiss1R、GnRH、GnIH的mRNA表达变化。结果:免疫组化结果显示,对照组和肥胖组大鼠的下丘脑LepR阳性着色见于细胞核的棕黄色着色,而Kisspeptin、Kiss1R、GnRH和GnIH其阳性信号均见于细胞质的棕黄色着色。相比较对照组,肥胖组大鼠其下丘脑弓状核LepR、Kisspeptin和GnRH表达显著减少,但两组Kiss1R和GnIH表达均无显著变化。Westem-Blot结果显示,较对照相比,LepR、Kisspeptin、KisslR、GnRH、GnIH在下丘脑均有阳性条带表达。灰度值分析结果显示,肥胖组大鼠LepR、Kisspeptin、GnRH蛋白表达明显下降,较对照组差异有统计学意义(P<0.05),而Kiss1R、GnIH表达未见明显差异(P>0.05)。qRT-PCR的结果显示,肥胖组大鼠LepR、Kisspeptin、GnRH的mRNA表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),而Kiss1R、GnIH的mRNA表达末见明显差异(P>0.05)。结论:高脂饮食诱导的肥胖导致大鼠下丘脑LepR明显降低、瘦素抵抗,最终导致Kisspeptin-GnRH分泌下调。肥胖对下丘脑-垂体-睾丸性腺轴产生的负性调节作用主要以Kisspeptin促进作用下调导致GnRH分泌减少为主实现,而并非以下丘脑生殖调控中枢的GnIH抑制作用上调实现。