乳腺癌目前的主要治疗手段是手术切除结合放化疗。乳腺癌死亡的患者中,约90％的人死于肿瘤转移。在肿瘤转移的过程中,肿瘤细胞往往发生上皮间质转化(EMT)。对肿瘤转移分子机制的研究有利于研发更有效的治疗手段。　　受体型酪氨酸磷酸酶D(Receptor-type tyrosine-protein phosphataseδ,PTPRD)属于受体型酪氨酸磷酸酶家族(Receptor-type tyrosine-protein phosphatase,PTPRs)，PTPRD基因位于染色体9p,最近在多种人类肿瘤中发现了PTPRD的基因缺失、基因突变或表观遗传学沉默,在这些肿瘤中存在着PTPRD的低表达或失活。所以认为PTPRD可能是抑癌基因。PTPRD可能通过其细胞粘附分子的作用调节肿瘤的转移,也可能通过其磷酸酶活性调节肿瘤的转移。STAT3是癌基因,作为信号转导子及转录激活因子,可以促进肿瘤的发生、促进转移、促进增殖、抑制凋亡。　　本实验主要研究PTPRD对乳腺癌侵袭和转移的作用,对乳腺癌干细胞的干细胞特性的影响,并研究PTPRD与白介素6(IL-6) STAT3信号转导通路的关系。　　第一部分 PTPRD下调对乳腺癌细胞增生、凋亡、迁移和侵袭的影响　　目的:探讨PTPRD下调对乳腺癌细胞增生、凋亡、细胞周期及迁移和侵袭能力的影响。　　方法:采用小RNA干扰的方法下调PTPRD的表达,化学合成PTPRD siRNA及对照无关序列(NC)转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,通过划痕实验、Transwell小室模型检测PTPRD下调对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响。Western Blot(WB)法检测EMT相关蛋白E-cadherin及Vimentin的表达。流式细胞技术检测化疗药物紫杉醇作用下,PTPRD siRNA对乳腺癌细胞凋亡的影响。CCK8实验检测PTPRDsiRNA对细胞增生的影响。流式细胞技术检测PTPRD siRNA对细胞周期的影响。　　结果:划痕实验及Transwell小室模型均发现转染了PTPRD siRNA的细胞迁移和侵袭能力显著高于无关序列NC组。细胞转染PTPRD siRNA后,其Vimentin表达上调,E-cadherin蛋白表达显著下调(P＜0.05)。化疗药物紫杉醇作用下,PTPRDsiRNA组凋亡水平显著低于NC组。PTPRD siRNA转染的细胞在细胞周期及细胞增生水平与NC没有差异。　　结论:PTPRD下调可以促进乳腺癌细胞系MDA-MB-231的迁移和侵袭,促进EMT。PTPRD下调对细胞凋亡具有抑制作用,但对细胞的增生和细胞周期没有显著影响。　　第二部分 PTPRD与乳腺癌干细胞之间的关系及小鼠成瘤实验　　目的:研究PTPRD下调对乳腺癌干细胞特性的影响。研究PTPRD及相关分子STAT3、P-STAT3,EMT相关分子E-eadherin及Vimentin在乳腺癌干细胞的表达。研究PTPRD下调对乳腺癌细胞在裸鼠中成瘤能力的影响。　　方法:通过免疫磁珠法从乳腺癌细胞系MDA-MB-231中分选出乳腺癌干细胞(CD44+/CD24-)及乳腺癌非干细胞(本文中以后简称非干细胞)。qRT-PCR及WB法检测PTPRD及STAT3在乳腺癌干细胞及非干细胞中mRNA及蛋白的表达,WB法检测P-STAT3、E-cadherin、Vimentin、ALDH1及OCT-4在癌干细胞及非干细胞中的表达。通过PTPRD siRNA下调乳腺癌细胞中PTPRD表达水平,无血清培养基悬浮培养干细胞球检测PTPRD下调对乳腺癌干细胞球形成能力的影响;克隆形成实验检测PTPRD下调对细胞克隆形成能力及全克隆形成能力的影响;流式细胞技术检测PTPRD下调对乳腺癌细胞中CD44+/CD24-细胞比例的影响;WB检测PTPRD下调对乳腺癌干细胞标记分子ALDH1及OCT-4的表达的影响。PTPRD ShRNA质粒转染乳腺癌细胞,1×106个细胞接种于裸鼠乳腺垫,检测PTPRD下调对乳腺癌细胞成瘤能力的影响。　　结果:PTPRD下调促进乳腺球的形成,乳腺球的数量及大小显著高于NC组(P＜0.05)。PTPRD下调促进乳腺癌细胞克隆形成能力,形成的克隆数及克隆的平均直径显著大于NC组(P＜0.05),且全克隆的比例显著高于NC组(P＜0.05)。转染有PTPRD siRNA的细胞中CD44+/CD24-比例显著上调。PTPRD shRNA转染的乳腺癌细胞在小鼠中的成瘤能力强于NC组,所形成的肿瘤直径显著高于NC组(P＜0.05)。PTPRD siRNA转染的细胞中癌干细胞标记分子ALDH1及OCT-4的表达显著高于NC组(P＜0.05)。通过免疫磁珠法成功分选出CD44+/CD24-的细胞群,癌干细胞标记分子ALDH1及OCT-4在CD44+/CD24-细胞群中的表达水平显著高于非干细胞组,说明成功分选出了乳腺癌干细胞。WB及免疫荧光法发现PTPRD在乳腺癌干细胞中的表达显著低于非干细胞,STAT3及P-STAT3在癌干细胞及非干细胞中的中的表达没有显著差异。EMT相关分子E-cadherin在癌干细胞中的表达显著低于非干细胞,而Vimentin在癌干细胞中的表达显著高于非干细胞(P＜0.05)。　　结论:PTPRD下调可以增强乳腺癌干细胞特性,乳腺癌干细胞中PTPRD低表达,提示PTPRD在乳腺癌的干细胞特性如自我更新及成瘤中起作用。CD44+/CD24-细胞群中E-cadherin下调,Vinentin上调说明乳腺癌干细胞具有间叶细胞表型。　　第三部分 PTPRD作用的分子机制的探讨　　目的:研究IL-6信号转导通路在乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用。研究PTPRD下调对STAT3活化的影响。研究IL-6作用于细胞的过程中,PTPRD水平变化及其与STAT3活化的关系,并检测此过程中EMT相关蛋白及干细胞标记分子的表达。　　方法:PTPRD siRNA转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,WB法检测PTPRD、STAT3及P-STAT3表达水平。IL-6作用于乳腺癌细胞系,分别于1小时(h)、3h、6h、12h、24h、48h检测PTPRD、STAT3、P-STAT3、E-cadherin、Vimentin、ALDH1及OCT-4的表达。划痕实验及Transwell小室模型检测IL-6对细胞迁移的影响,CCK8实验检测IL-6对细胞增生能力的影响。　　结果:IL-6促进乳腺细胞的迁移和侵袭。IL-6作用过程中,STAT3从1h即有活化,活化水平逐渐增高,PTPRD表达在6-24h显著上调,48h恢复正常水平甚至略有下调。在此过程中,EMT相关分子E-eadherin表达下调,Vimentin表达上调;干细胞标记分子ALDH1及OCT-4表达上调。PTPRD在PTPRD siRNA转染细胞中的水平显著低于NC组,STAT3的表达在PTPRD siRNA组及NC组没有差异,而P-STAT3在PTPRD siRNA组中表达显著上调。　　结论:PTPRD可以使P-STAT3去磷酸化而失活;IL-6激活STAT3的过程中,可以促进PTPRD的表达。这提示PTPRD是IL-6 STAT3通路的抑制因子。当IL-6激活STAT3后,PTPRD水平同时上调,从而使活化的STAT3迅速去磷酸化而失活,预防该通路的过度活化,保持细胞稳态。IL-6可以促进EMT,并促进干细胞标记分子的表达。　　第四部分 PTPRD、P-STAT3在乳腺癌组织中的表达与临床病理特点和预后的关系　　目的:对比研究PTPRD及P-STAT3在乳腺癌及正常乳腺中的表达水平;研究PTPRD及P-STAT3的表达与乳腺癌大小、TNM分期、分级等临床病理特点的关系;研究PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中的表达与患者预后的关系。　　方法:收集乳腺癌肿瘤76例,正常乳腺10例,免疫组织化学方法检测PTPRD、P-STAT3在乳腺癌组织及乳腺组织中的表达。收集临床病理资料,并进行随访调查预后。SPSS19.0统计软件统计PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中的表达,统计PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中表达与肿瘤患者年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤分级、肿瘤的分子分型、乳腺癌中HER2、ER、PR及PCNA表达的关系。Kaplan-Meier法分析PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中的表达与预后的关系。　　结果:PTPRD在乳腺癌中的表达与正常乳腺中的表达没有显著差异。P-STAT3在乳腺癌中的表达显著强于乳腺组织。PTPRD的表达与肿瘤大小及ER的表达显著相关(P＜0.05)。PTPRD表达低的肿瘤直径更大,ER表达低的肿瘤中PTPRD的表达相对也低。P-STAT3在肿瘤中的表达与肿瘤的分级有关(P＜0.05)。P-STAT3在级别低的肿瘤中表达相对高。PTPRD与P-STAT3在乳腺癌中的表达呈正相关。PTPRD在乳腺癌中的表达与预后不具显著相关性。P-STAT3表达低的患者预后不良(P＜0.05)。　　结论:PTPRD在乳腺癌中主要与乳腺癌直径大小有关,PTPRD表达低的乳腺癌直径大,可能在乳腺癌中发挥抑癌基因的作用。P-STAT3在乳腺癌中与肿瘤分化密切相关,P-STAT3表达高的乳腺癌预后相对好。