1研究背景生物信息学作为生命科学和计算机与信息科学相互结合而形成的一门学科,为储存、检索和分析人类基因组的生物学数据提供了新的思路与方法。在如今“大数据”时代的背景之下,其应用已不局限于人类基因组计划的研究,而是涉及基因组学、蛋白质组学、比较基因组学、宏基因组学、基因和蛋白质的表达与分析、生物芯片表达谱分析、蛋白质相互作用网络、生物系统模拟、系统生物学以及网络生物学研究等多个方面。生物信息学从分子生物学水平以系统观、信息化和复杂性的角度研究疾病与健康相关的前沿和热点问题,推动着生命科学乃至自然科学的发展。抑郁症是现代医学的疾病名称,中医学虽无“抑郁症”的病名,但考究其临床表现,可归属为“郁病”、“脏躁”以及“百合病”等范畴。目前抑郁症的发病机制尚缺乏完全的认识,亦缺乏相对客观检测指标。在治疗中也有接近一半的抑郁症患者无明显效果。因此,利用生物信息学技术开展与抑郁症的诊断和治疗密切相关的转录因子-miRNA-lncRNA调控网络等对抑郁症的机制研究、诊断和治疗等方面具有重要的意义。古方逍遥散共载药8味,具有疏肝解郁,养血健脾的功效。历代医家对逍遥散的应用已拓展至临床各科,涵盖包括抑郁症在内的多种身心疾病。课题组前期针对抑郁症的可能涉及的发病机制,重点从神经突触可塑性、HPA轴、神经营养因子、神经元微结构、脑肠肽、肠道菌群以及代谢组学等多方面展开研究,部分揭示了逍遥散抗抑郁作用的机制,并认为逍遥散具有“多成分、多靶点、多途径”的特点。然而,正是由于逍遥散“多成分、多靶点、多途径”的特点和复杂性,使得其抗抑郁作用机制的研究面临着困难和挑战。具体而言,逍遥散中的8味中药包含数百种以上化合物,这些化合物之间又可以相互影响、相互作用。那么,逍遥散中这些纷繁复杂的化合物中究竟何种成分作用于什么靶点,又影响到哪些具体的调控通路,涉及到哪些系统和途径呢?包括古方逍遥散在内的众多中药复方药效物质基础和作用机制能否用现代医学的语言进行阐释呢?这一系列的问题很难运用传统实验手段进行研究,也同时成为现代中药复方药效物质基础及作用机制研究中遇到的瓶颈。近几年来,英国药理学教授Hopkins提出“网络药理学”的概念,利用生物信息学技术分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”的协同作用关系,这与中医学的“整体观念”和中药复方“多成分、多靶点、多途径”的作用特点相互契合,给中药复方的药效物质基础研究开辟了新的研究思路。因此,我们在前期工作的基础上借助生物信息学的分析技术,开展逍遥散相关的网络的构建和分析,分析中药活性成分、潜在作用靶点,预测可能涉及的生物学过程和信号通路,探讨潜在药理学机制,最后结合生物信息学的结果有针对性的进行动物实验探索,以期用较高的效率和更科学的策略揭示逍遥散的药效物质基础和作用机制。2研究方法本研究主要由生物信息学分析和实验研究两大部分组成。生物信息学分析:(1)在GEO数据库中检索抑郁症患者基因芯片表达数据集;数据预处理和差异表达分析;筛选抑郁症潜在相关基因;加权基因共表达网络构建及显著特征功能模块的识别;显著特征功能模块的功能富集分析及蛋白质相互作用网络构建;转录因子-miRNA-lncRNA调控网络构建;样本聚类与分子分型分析;(2)联合检索TCMID、ETCM、BATMAN-TCM和TCMSP数据库中逍遥散中药物信息;构建中药“成分-靶点-通路/疾病”网络;在CTD数据库中检索与抑郁症相关的靶点信息;构建逍遥散“成分-靶点”和“化合物靶点-抑郁症疾病靶点”网络;对“化合物靶点-抑郁症疾病靶点”进行聚类功能模块构建;聚类功能模块的生物信息学分析;基于ADME的活性成分筛选与虚拟分子对接。实验研究:(1)采用CUMS 6周法复制了抑郁模型大鼠,通过宏观表征、体重、旷场实验、糖水偏好实验以及强迫游泳实验对模型进行评价并观察逍遥散的干预作用;(2)结合生物信息学分析中的分析结果,应用免疫组化法检测各组大鼠前额叶皮质CNR1、CNR2和BDNF蛋白的表达;应用实时荧光定量PCR检测各组大鼠前额叶皮质Cnrl mRNA、Cnr2 mRNA和Bdnf mRNA的表达;应用Elisa检测各组大鼠前额叶皮质cAMP、PKA和P-CREB的含量。3研究结果生物信息学分析:(1)筛选出28个抑郁症相关基因,构建了抑郁症的加权基因共表达网络,并识别出1个与抑郁症呈负相关的显著特征功能模块;显著特征功能模块中的基因用于构建蛋白质相互作用网络,并发现在5条KEGG通路和11个基因本体生物过程中存在显著富集;蛋白质相互作用网络中筛选出5个关键基因(FOS、GMGT1、JUN、EGR1以及CCL4);构建了抑郁症的转录因子-miRNA-lncRNA多因子调控网络,并根据多因子调控网络的“Degree”值对排行前10位基因进行了分析,其中包括3个核心基因、6个lncRNA和1个miRNA。根据5个基因(TCTEX1D4、AREG、C6orf222、PPP1R15A和TNFSF9)在抑郁症样本中的差异性表达,发现抑郁症还可再分为2大类型,这5个基因可能是区分抑郁症亚型的重要基因;(2)构建了逍遥散内中药的“成分-靶点-通路/疾病”网络和逍遥散全方的“成分-靶点”和“化合物靶点-抑郁症疾病靶点”网络并进行生物信息学分析;“化合物靶点-抑郁症疾病靶点”的网络模块聚类分析共获得23个模块,其中有8个模块含有逍遥散与抑郁症共同靶点;网络聚类分析共获得8个包含有逍遥散与抑郁症共同靶点的子网络功能模块,涉及到的具体靶点为 CNR2、HTR2A、HTR7、DRD5、SLC6A4、IL2、PTGS2、CAT、ADORA2A、MTHFR、XDH、NR3C1 以及 ACSL4,最显著富集的 KEGG 通路分别是cAMP信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、谷胱甘肽代谢通路、可卡因成瘾、非酒精性脂肪肝、嘌呤代谢、长寿调节、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路等;结合ADME模块筛选和虚拟分子对接实验结果,共鉴别出10个活性化合物与4个逍遥散与抑郁症共有靶点之间具有较高的亲和力。其中,与靶点CNR2有较高亲和力的化合物有菜豆异黄烷(Phaseollinisoflavan)、3-甲氧基光甘草定(3’-Methoxyglabridin)以及甘草素(Liquiritigenin);与靶点NR3C1有较高亲和力的化合物有异热马酮(Isoramanone)、γ-谷甾醇(Gamma-Sitosterol)、β-谷甾醇(Beta-Sitosterol)以及除虫菊素2(Pyrethrin II);与靶点SLC6A4有较高亲和力的化合物为延胡索乙素(Tetrahydropalmatine);与靶点CAT有较高亲和力的化合物为齿孔醇(Eburicol)和豆甾醇(Stigmasterol)。实验研究:(1)采用CUMS 6周造模方法成功复制了抑郁模型大鼠。给予药物干预后,逍遥散组大鼠的抑郁样行为有所改善,与模型组相比一般状态较好,体重增长明显,糖水实验中糖水偏好率升高,旷场实验中运动总距离、中央区域停留时间和进入中央区域次数提高,强迫游泳实验中不动时间缩短;(2)模型组大鼠前额叶皮质Cnr1 mRNA、Cnr2 mRNA 以及Bdnf mRNA 的表达,CNR1、CNR2 以及 BDNF蛋白的表达,cAMP、PKA以及P-CREB的含量均明显低于正常组;与模型组比较,逍遥散组大鼠前额叶皮质Cnr1 mRNA、Cnr2 mRNA以及Bdnf mRNA的表达水平显著上调,CNR1、CNR2以及BDNF蛋白的表达水平有所增加;逍遥散组大鼠前额叶皮质cAMP、PKA以及P-CREB的含量明显增加。4研究结论生物信息学分析:(1)通过整合生物信息学分析结果,筛选出FOS、GNGT1、JUN、EGR1以及CCL4为与抑郁症相关的核心基因,FOS、PTGS2、JUN、XIST、NEAT1、SNHG16、NORAD、MALAT1、ARHGAP27P1-BPTFP1-KPNA2P3次及hsa-miR-106a-5p这10个基因为转录因子-miRNA-1ncRNA的多因子调控网络中的关键基因,TCTEX1D4、AREG、C6orf222、PPP1R15A和TNFSF9这5个基因是区分抑郁症分子分型的潜在基因;(2)逍遥散全方的“成分-靶点”和“化合物靶点-抑郁症疾病靶点”网络的生物信息学分析结果体现了中药复方逍遥散抗抑郁作用具有“多成分、多靶点、多途径”的特点;(3)通过ADME模块筛选和虚拟分子对接实验共发现逍遥散中药物所包含的10个活性化合物和4个逍遥散与抑郁症共同作用靶点之间具有较高的亲和性,是潜在的具有抗抑郁作用的活性化合物。实验研究:在生物信息学分析结果基础上,动物实验表明逍遥散可影响CUMS抑郁模型大鼠前额叶皮质Cnr1 mRNA和Cnr2 mRNA的表达,并可能通过cAMP-PKA-CREB通路提高BDNF的水平而发挥抗抑郁作用。