目的:斑马鱼鱼卵凝集素（zebrafish fish-egg lectin,z FEL）是一种具有抗菌作用的鱼类母源性免疫因子,能够提高鱼卵的生存率,是斑马鱼中的一种先天性免疫分子。研究发现其对鲤鱼巨噬细胞具有调理作用,能够促进鲤鱼巨噬细胞对病原微生物的吞噬。但对其他物种是否也具有调理作用目前没有研究,本课题为进一步探索z FEL在其他物种中的调理作用,充分挖掘z FEL的应用潜能,揭示早期免疫分子在高等哺乳动物中具有的潜在免疫作用,以小鼠巨噬细胞为实验对象设计系列实验。方法:1.检测z FEL对RAW 264.7细胞的细胞毒性与凋亡作用。培养RAW 264.7细胞,将其与z FEL共孵育24 h后,在显微镜下观察RAW 264.7细胞的形态变化。通过细胞毒性实验检测不同浓度的z FEL对RAW 264.7细胞的细胞毒性,据此确定z FEL的最佳使用浓度。流式细胞术来检测与z FEL孵育后的RAW 264.7细胞的凋亡情况,以检测z FEL对细胞活性的影响。2.z FEL对巨噬细胞吞噬功能的影响。FITC荧光染料标记大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,将标记好的细菌分别与PBS和z FEL孵育。孵育结束后采用流式细胞术分别检测RAW 264.7细胞与小鼠腹腔巨噬细胞对荧光标记细菌的吞噬能力。3.转录组学分析z FEL的潜在作用机制。为了进一步探究z FEL的调理机制,我们将RAW 264.7细胞与z FEL进行共同孵育,并提取其总RNA,建立RNA文库进行转录组测序,PBS处理组作为阴性对照,统计两组细胞的差异基因,KEGG通路分析得到z FEL参与的主要信号通路。4.z FEL处理组细胞表面标志物的检测。RAW 264.7细胞与z FEL共孵育24 h后,通过流式细胞术检测细胞表面标志物CD80、CD86和MHC II的表达情况,同时提取同样处理的RAW 264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的总RNA,采用q PCR技术检测CD80、CD86和MHC II m RNA的表达。5.探究z FEL对巨噬细胞分型的影响。将z FEL孵育后的RAW 264.7细胞通过流式细胞术检测M1型巨噬细胞的表面标志物CD11c以及M2型巨噬细胞的表面标志物CD206的表达水平。同时使用q PCR技术检测细胞因子TNF-α、TGF-β和IL-6的m RNA表达水平,进一步验证巨噬细胞极化方向。6.提取z FEL孵育后的RAW 264.7细胞的总蛋白来分析z FEL参与细胞活化的信号通路。Western Blot检测p38和NF-κB蛋白的磷酸化水平。结果:镜下观察到z FEL孵育后的RAW 264.7细胞的形态发生显著变化,细胞长出触角,由圆形变为长梭形,胞质内颗粒增多表明细胞被激活。CCK-8实验结果显示在实验浓度下z FEL对细胞无毒性,并且能够抑制细胞的凋亡。促吞噬实验表明,z FEL可以作为调理素增强RAW 264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞对病原体的吞噬作用。转录组学结果分析以及细胞表面标志物检测显示,z FEL通过诱导CD80、CD86和MHC II的表达来激活巨噬细胞,并诱导M1型标志CD11c高表达,使得巨噬细胞向M1型极化。Western Blot结果表明z FEL可以通过诱导p38和NF-κB的蛋白磷酸化来激活巨噬细胞。结论:综上所述,z FEL能够上调小鼠巨噬细胞的抗原提呈能力,诱导小鼠巨噬细胞向M1型极化,增强了小鼠巨噬细胞的吞噬功能。z FEL的调理活性不仅仅局限于鱼类中,在哺乳动物细胞中也可以发挥作用,以上结果表明z FEL在高等动物中作为调理素具有潜在的应用价值。