IGFs系统对发育、生长和生殖都起着重要的调控作用。胰岛素样生长因子酸不稳定亚基(insulin-like growth factor acid-labile subunit, IGFALS)是IGFs系统中的重要一员,可以与IGFs、IGFBP3/5形成三聚体,延长IGFs半衰期,从而参与对IGFs的调控。IGFs系统中的配体和受体以及结合蛋白都受到高度重视,得到了深入而广泛的研究,但迄今为止,对IGFALS的研究仅限于哺乳动物出生后生长过程。为阐明IGFALS的功能,我们用斑马鱼作为研究模型,联合使用PCR、RT-PCR、荧光定量RT-PCR、RACE、western blot、原位杂交、显微注射、过表达、生物软件分析等技术和方法对IGFALS进行研究,研究结果如下。斑马鱼IGFALS基因位于第3号染色体上,DNA序列长为3694bp,包括2个外显子(长度分别为58bp和3466bp)和1.个内含子(170bp)。开放阅读框位于第二外显子中,长度为1845bp,编码20种614个氨基酸残基,其中亮氨酸含量达到20.5%,推测分子量为69127.8Da,等电点为7.65。N-端的前19个氨基酸为信号肽,成熟肽中含有19个亮氨酸富集重复基序(LRR),每个LRR包括24个氨基酸残基,可以用xLxxLxLxxNxLxxLxxxxFxxLx表示,L、N、F分别主要代表Leu、Asn、Phe,各LRR中保守氨基酸的保守程度存在差异。IGFALS氨基酸序列中包含11个半胱氨酸残基和5个天冬酰胺糖基结合位点,与哺乳动物分布位点相比,其中10个Cys分布相同,2个糖基结合位点分布相同。蛋白二级结构包括α-螺旋、延伸链、β-转角、随机卷曲,其中α-螺旋最为丰富(占50.98%),β-转角在LRR的分布位置稳定。IGFALS三级结构形似马蹄,C-端和N-端均向内折,彼此靠近,19个LRR分布不均匀,负电荷主要分布在C-端和N-端,正电荷主要分布在LRR表面。斑马鱼IGFALS氨基酸序列与其它动物差异性很大,与麻雀差异最小(43.9%),与海鞘的差异最大(85.8%),和哺乳动物的差异为48.0-50.8%。在IGFALS系统发育树上,斑马鱼和爪幨亲缘关系最近。克隆得到了GC含量较低的斑马鱼igfals5’端侧翼序列2910bp。和哺乳动物不同,序列中具有TATA-box、CAAT-box和GC-box元件,并且均为两个,这暗示斑马鱼igfals可能能够转录两种mRNA。在该序列的215个区域出现了54种转录因子结合位点,GH的应答元件为GAS2,无GAS1。将不同长度5’侧翼序列连接到pGL3 basic和pEGFP enhancer载体中成功构建了重组质粒P1-P7和EP1-7,发现斑马鱼igfals5’侧翼序列中在-372至-812区域内有启动子活性,在-1623至-2041区域存在能够使启动子转录活性急剧增强的元件。注射EP1后,从19hpf开始可以在斑马鱼胚胎中观察到EGFP表达,而且均表达在体表细胞上。斑马鱼igfals mRNA表达在成鱼多种组织器官,在雌雄鱼的肝胰脏中表达最多,肠道、脾脏、肾脏、肌肉、鳃中表达较强,眼睛、脑和心脏中表达微弱,但在雌雄性腺中的表达存在差异。雌雄斑马鱼肝胰脏igfals的表达水平在一个繁殖周期(7d)内的变化趋势相同,交配后0d显著降低,交配后1d急剧升高,从第2天开始没有显著差异。雌雄鱼肝脏igfbp5 mRNA变化趋势相似,igfs mRNA和igfbp3 mRNA变化在雌雄鱼之间则几乎相反,不过同一性别各种igfs mRNA的变化相似,其它基因的变化趋势则差异很大。在一天内,光照条件变化对处于产卵周期中的斑马鱼雌鱼IGFs系统基因的表达存在显著影响,但对非产卵周期的斑马鱼影响不显著。在6hpf斑马鱼胚胎中可以检测到微弱的igfals mRNA,之后表达量上升,24hpf-48hpf表达量变化不明显,5dpf时表达量大幅度增加。利用pCS2+MT质粒成功构建了IGFALS的融合表达载体pALSMT,过表达IGFALS之后,斑马鱼胚胎出现了如下表型：眼部轮廓模糊,脑部体积减小,不能形成正常脊索,两排体节之间的宽度增加,单个体节的宽度减小,脊背神经组织扭曲,身体背部加宽,体节模糊,体节数减少,体长显著变短,但是对尾芽、近轴中胚层和后脑菱脑节的发育没有显著影响。IGFALS过表达明显增加了igf2a、igf2b、igfbp3、gh、ghr的mRNA水平,但对igf1ra、igf1rb、igfbp5、gh的表达没有显著影响,igf3的表达水平在10hpf显著降低,在24hpf显著升高。过表达IGFALS之后,JAK2的磷酸化水平显著升高,AKT的磷酸化程度没有显著性变化,表明IGFALS(?)(?)可能通过JAK2信号通路影响胚胎发育。在一个产卵周期内,卵巢igfals的表达水平在产卵后3-5d显著升高。igfals在卵巢的滤泡细胞中表达。igfals能够显著促进斑马鱼卵母细胞的成熟。繁殖周期内卵巢igfs和igfbp3/5的表达变化趋势和igfals明显不同,各种igfs mRNA的变化趋势也存在差异。雄性信息素对igf2b和igfbp3的表达有负调控作用。处于产卵周期中的斑马鱼卵巢igfals的表达受光周期影响。DES、DHP、hCG能够显著促进滤泡细胞igfals的表达,E2则对卵巢igfals的表达没有显著影响。igfals和DES、hCG、DHP共作用对卵母细胞成熟的促进,在一定剂量范围内具有协同效应。饥饿显著增加斑马鱼肝脏igfals和igfbp3的表达,不同饥饿时间对表达量的影响存在差异,恢复投喂后表达量先升高后急剧下降至正常水平,但是对igf1表达水平的影响则不显著。腹腔注射GH对斑马鱼肝脏igfals、igf1、igfbp3表达水平的影响相似,先显著抑制表达水平,之后和对照组没有显著差异。腹腔注射E2后肝胰脏中igfals和igfbp3 mRNA水平的变化趋势相同,均为先显著低于对照组,后显著高于对照组,最后恢复到正常水平,但对igf1 mRNA水平的影响不同。斑马鱼IGFALS无论是在基因结构、碱基组成、推导氨基酸的组成以及蛋白质空间构象,还是在启动子序列、转录因子结合位点都和哺乳动物差异较大,另外在GH等刺激作用下,斑马鱼igfals基因表现出和哺乳动物不同的变化趋势,表明igfals基因在斑马鱼中的功能可能和哺乳动物存在差异。在斑马鱼igfals启动子序列中存在54种215个转录因子结合位点,有很多潜在的调控因子,并且在很多情况下,igfals和三聚体其它2个基因的表达水平完全不同,表明igfals基因在斑马鱼发育和生命活动中的功能可能远比目前了解的要复杂。因此通过对斑马鱼igfals的研究,希望能够为揭示IGFALS在低等脊椎动物生长和发育中的功能,为探讨IGFALS在调控脊椎动物生长发育过程中的机制,以及为更加全面和深入了解IGF系统在生物体内的功能提供重要的资料。