论文部分内容阅读
背景：胚胎滋养细胞在胚胎植入和胎盘发育的过程中起着至关重要的作用,胚胎植入时,滋养细胞粘附并侵入母体子宫内膜,最终形成胎盘。胚胎植入后,滋养细胞利用侵袭完成对子宫螺旋动脉的重塑,为胎儿与母体之间的物质交换与氧气运输提供基础,保障胎儿正常发育。一旦滋养细胞侵袭能力下降,就可能导致胚胎着床失败、先兆子痫(pre-eclampsia)、自发流产(spontaneous abortion)以及胚胎发育受损。滋养细胞的侵袭主要受到细胞因子、趋化因子、整合素(integrin)以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的调控。其中,基质金属蛋白酶能够降解滋养细胞外基质的绝大多数成分,为滋养细胞的侵袭扫清障碍。另一方面,母胎界面的免疫耐受能使胎儿免受母体的免疫排斥,其中蜕膜免疫细胞在维持免疫耐受的过程中起着重要的作用。巨噬细胞在母胎界面中主要极化为M2型巨噬细胞,分泌高水平的抑制性细胞因子IL-10,低表达前炎性细胞因子IL-1β,有利于维持免疫耐受及妊娠。大量证据显示,三氯生(triclosan, TCS)可能与妊娠早期胚胎植入失败、妊娠中后期胚胎发育不良以及流产相关。TCS是一类环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disruptors, EEDs),在日常生活中广泛存在。由于具有广谱抗菌的作用,TCS经常被添加于牙膏、肥皂以及洗发水等日常生活用品中。TCS的结构与雌激素非常类似,它能够模拟雌激素结合雌激素受体(estrogen receptor, ER)进入细胞,并通过影响母体雌激素和甲状腺激素的表达和分泌来影响胎儿的发育。不过,三氯生影响胚胎植入以及自发流产的相关分子机制目前尚不清楚。目的：研究TCS对母胎界面滋养细胞侵袭的影响及其相关分子机制；研究TCS对妊娠中期蜕膜巨噬细胞极化的影响,为EEDs导致的病理性妊娠的预防和治疗提供新的策略和思路。方法：1.总体设计：为了研究TCS对胚胎植入期的影响,我们首先建立TCS诱导的小鼠植入期流产模型,观察TCS对于小鼠胚胎植入的影响。然后通过细胞侵袭实验观察TCS是否能在体外影响人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo的侵袭；通过细胞划痕实验观察TCS能否影响HTR-8/SVneo细胞的迁移。接下来,我们在体内体外分别检测在TCS的刺激下,调控滋养细胞侵袭的基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达是否受到影响。在体外检测信号通路相关分子的磷酸化水平,推测TCS通过哪条信号通路影响MMPs的表达进而影响滋养细胞的侵袭；使用SOCS3 siRNA沉默SOCS3基因的表达,激活JAK2/STAT3信号通路,再通过侵袭实验确认TCS是否仍能影响滋养细胞的侵袭,并检测MMPs的表达,从而确认TCS是否通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活下调MMPs的表达进而影响滋养细胞的侵袭。此外,为了研究TCS对妊娠中期的影响,我们首先建立了TCS诱导的小鼠妊娠中期胚胎流产模型,观察TCS对于胚胎中期孕鼠自发流产率的影响；并从孕鼠子宫中分离蜕膜组织,在mRNA水平上检测蜕膜组织中M1型和M2型巨噬细胞相关分子的表达。2.TCS对孕鼠胚胎植入的影响将6-8周性成熟的ICR雌鼠与雄鼠合笼,分别于每天早晨8：00及晚上8：00检查雌鼠阴道栓,检栓阳性记为孕0.5天,将孕鼠随机设置DMSO对照和TCS处理组,连续灌胃至孕4.5天。在孕5.5天时用台盼蓝对孕鼠进行尾静脉注射,之后颈椎脱臼处死,取小鼠子宫,统计小鼠的胚胎植入数。3.TCS对滋养细胞侵袭的影响将HTR-8/SVneo细胞悬液加入铺有基质胶的小室中,置于24孔板内,每孔加适量完全培养基。TCS处理24小时后,结晶紫染色,用正置显微镜观察小室中侵袭的滋养细胞并进行计数。4.TCS对滋养细胞迁移的影响通过细胞划痕实验来验证TCS是否能够抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移。5.TCS对子宫基质金属蛋白酶表达的影响从孕鼠体内分离得到子宫,提取其组织蛋白,使用蛋白质印迹法(Western blotting, WB)方法检测母胎界面基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。6.TCS对滋养细胞基质金属蛋白酶等调控分子表达的影响使用Western blotting检测TCS处理后HTR-8/SVneo细胞基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9、粘附分子CD146和整合素integrinβ1的表达情况。7.TCS对滋养细胞部分信号通路的影响使用Western blotting分别检测TCS处理HTR-8/SVneo后ERK1/2、AKT和JAK2/STAT3的磷酸化情况；并检测JAK2/STAT3通路的抑制蛋白SOCS3的表达情况。分别用ERK1/2和AKT的抑制剂与TCS同时处理HTR-8/SVneo, Western blotting检测MMP-2的表达；将SOCS3 siRNA转染入HTR-8/SVneo细胞,Western blotting检测SOCS3、p-STAT3以及MMP-2的表达,侵袭实验检测TCS对滋养细胞侵袭的影响。8.TCS对妊娠中期孕鼠流产率的影响将6-8周性成熟的ICR雌鼠与雄鼠合笼,分别于每天早晨8：00及晚上8：00检查雌鼠阴道栓,检栓阳性记为孕0.5天,随机设置DMSO对照和TCS处理组,连续灌胃至孕14.5天。在孕15.5天时将孕鼠颈椎脱臼处死,取小鼠子宫,统计小鼠的胚胎流产率。9.TCS对妊娠中期巨噬细胞极化的影响Q-PCR检测孕15.5天孕鼠蜕膜组织中TNF-α、IL-6、IL-1p、CD206、IL-10以及Yml mRNA水平的表达。结果：TCS能够显著降低孕鼠的胚胎着床率,并下调子宫基质金属蛋白酶MMP-2的表达。细胞侵袭实验证明,TCS能够显著影响滋养细胞的自发侵袭；细胞划痕实验证明,TCS能够显著影响滋养细胞的迁移。在体外,TCS也能够显著提高MMP-2的组织抑制剂TIMP-1和TIMP-2的表达,降低滋养细胞MMP-2的表达。TCS能够显著激活滋养细胞内ERK和AKT的磷酸化,同时通过促进SOCS3的表达抑制JAK2/STAT3信号通路激活。使用SOCS3 siRNA沉默滋养细胞内SOCS3的表达,可以恢复TCS对滋养细胞侵袭的抑制,同时也恢复了MMP-2的表达。在妊娠中期TCS能够显著提高孕鼠胚胎流产率,并提高M1型巨噬细胞相关分子TNF-α、IL-6、IL-1p的表达,降低M2型巨噬细胞相关分子CD206的表达。结论：在胚胎植入期,TCS能够通过促进JAK2/STAT3通路抑制蛋白SOCS3的表达抑制JAK2/STAT3信号通路的激活,下调MMP-2的表达,从而影响滋养细胞的自发侵袭,最终导致孕鼠胚胎着床率的下降。而在妊娠中期,TCS可以通过改变巨噬细胞的极化,破坏免疫耐受,进而导致孕鼠流产的发生。