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葡萄做为最具有经济价值的果树作物之一,在世界范围内被广泛种植。2013年,全球葡萄年产量达到了7.7千万吨,我国以超过一千万吨的年产量位居世界第一(FAO,2013)。然而,在种植面积和年产量不断增加的背景下,如何保障生产安全是葡萄产业面临的严峻考验。与其他作物一样,葡萄受到病毒、细菌和真菌等多方面的威胁,其中,葡萄白粉病就是一种广泛流行的活体专性寄生的真菌病害,在世界范围内造成了严重的经济损失。然而,作为酿酒和鲜食主要原料的欧洲种葡萄,却几乎全部不能抵抗白粉病的危害。目前,寻找和培育对白粉病在内的多种真、细菌病原抗性品种是葡萄育种研究的重点。在我国,大量的研究积累证明来源于中国的野生葡萄具有优良的抗病、抗逆特性,然而,其中的分子机理了解不足。据此,本研究以探索中国野生葡萄抗白粉病的机理为目的,选取了具有不同白粉病抗性的野生葡萄,通过大规模测序技术,对其不同白粉病侵染阶段的转录组进行结构变异分析,同时还对感病和抗病葡萄在不同侵染时期的基因表达差异进行了系统研究。最后,对一个转录组中差异表达的重要激酶BAK1和一个前期mRNA差异显示文库中筛选到的凝集素受体激酶(LecRK)进行了抗病功能验证。获得以下主要研究结果:1.对三个具有不同抗性的野生葡萄的转录组进行了从头(de novo)拼接,通过与葡萄参考基因组全面的比较,发现了大量的野生葡萄特异基因和丰富的遗传变异资源,例如SNPs和小片段的插入和缺失(indels)。在每个野生材料中找到了超过1,000个特异基因和600-700个非编码转录本,并且发现~30%的特异基因的功能与植物的防御反应有关。这些特异基因中富集了大量的植物响应病原菌侵染的生理过程和一些例如香豆素类植保素的合成过程。进一步的分析结果发现,6-10%的特异基因被预测为受体类激酶,8%的特异基因为NBS-LRR类抗病基因,而这两类基因都被认为能在植物免疫反应的不同层面中识别病原菌并且传递免疫信号。同时,大量的此类特异基因的存在,也说明这些直接或间接与病原菌互作的基因,可能受到了选择作用而表现出了较高的序列多态性。同时本研究还在野生葡萄和葡萄参考基因组PN40024之间找到了87,000-110,000个纯和的SNPs和约2,000个小片段的indels,并且对这些变异可能产生的影响进行了全面的预测。此外,通过链特异的RNA-Seq文库,还找到了100-200对cisNAT,这些转录本中显著富集了参与次生代谢途径和非生物胁迫途径的转录本,预示了野生葡萄中cis-NATs的潜在调节功能。2.以白粉病高抗和高感的野生葡萄为材料,对处于不同侵染阶段的组织进行了表达谱分析,在所有的样品比较中,总共找到了6,953个显著差异表达的基因。通过对这些差异基因进行表达模式聚类分析发现,有相当一部分同簇基因在不同抗性材料中表达模式一致,即不同抗性野生材料中该类基因对病原菌的响应一致。但也有一类重要的抗病基因,在不同材料中表现出了不同的响应模式。带有NBS结构域的R基因在感病材料中显著全程抑制,而含有受体域的R基因则在抗病材料中显著诱导。此外,本研究还在侵染初期的感病材料中发现了大量下调富集的生物过程,其中有很多跟植物抗病相关。通过差异基因的代谢通路富集性分析发现,一些与抗病相关的常见次生代谢在不同抗性的植株中均上调富集,而一些在葡萄中报导较少的初级及次级代谢途径,则在两个株系中表现出不同的富集模式。3.在前期的mRNA差异显示文库中,获得了一条抗病候选基因片段,进一步分析后发现该片段在抗病与感病的野生葡萄接种白粉菌后均被诱导表达,但是呈现出不同的表达模式。克隆测序后发现其包含有一个G型lectin结构域、跨膜域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,可以划分为凝集素类受体激酶(LecRK)。亚细胞定位试验也证明其蛋白在拟南芥的原生质体中可以被定位到细胞膜上,证实其为膜蛋白。超表达VqLecRK1的拟南芥植株表现出了对活体型寄生菌(白粉菌和Pst DC3000)显著增强的抗性,并且出现了一些常见的抑制活体寄生菌的防御反应(胼胝质的大量积累和活性氧的爆发及集中出现的细胞死亡)。此外异源表达VqLecRK1的拟南芥植株在经PAMPs处理和Pst DC3000接种后,表现出了不同程度增强的PTI反应(如:胼胝质的累积和气孔开张度的变化),说明葡萄中VqLecRK1参与了这些病原菌的响应过程。4.转录组的前期结果显示葡萄的SERK基因家族可以被白粉病菌显著诱导表达,并且不同成员之间表现出不完全一致的表达趋势,其中VqBAK1(VqSERK3)的基础表达最大且增强幅度较大。本研究克隆了野生毛葡萄里的BAK1基因,并且证实它定位于细胞膜上。在拟南芥bak1-4突变体中异源表达VqBAK1基因,发现它可以恢复bak1-4突变体因缺失AtBAK1而出现的细胞死亡,说明其也具有控制细胞死亡的能力。此外,本研究还发现超表达VqBAK1的拟南芥表现出对Pst DC3000增强的抗性和增强的PAMP诱导的PTI反应。综上,证实VqBAK1的功能相对保守,在葡萄中也具有控制细胞死亡和增强PTI信号的功能。