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聚合酶链式反应(PCR)技术自1985年问世以来，因其灵敏度高、特异性强和检测速度快等特性，被广泛的应用于医学和分子生物学等诸多领域。PCR结果的准确性很大程度上取决于待检样本核酸的质量。然而，用于PCR检测的样本在采集、运输、保存等过程中，受人为和客观因素的影响，会导致核酸降解等而影响被检核酸的质量，造成PCR检测结果的假阴性，因此样品的核酸质量控制系统显得尤为重要。目前用于鸟类PCR分子检测的质量控制系统只有外源性控制系统，相比内源性控制系统有很大的缺陷。本研究建立了适用于所有鸟类PCR分子检测的内源性内部控制(endogenous internal control，EIC)系统，实现了鸟类样本从采集到PCR检测的全程质量监控。
1.一种基于HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统的建立
在本论文的研究一中，设计了一套针对鸟类的羟甲基胆色烷合成酶(hydroxymethylbilane synthase，HMBS)基因的SYBR Green定量PCR系统，鸟类HMBS基因是鸟类被检组织或器官自带的内参基因。本实验建立的内源性内部控制系统可特异性扩增8种鸟类（鸡、鸭、鹅、鸽子、大雁、天鹅、鹳鹤、鹌鹑）咽喉拭子的核酸、鸡的11种组织或器官、7种中国地方品种鸡（青壳蛋鸡、琅琊白条、芦花鸡、如皋黄鸡、仙居鸡、胡须鸡、青光鸡、白耳鸡、高居鸡）血样的核酸，而不会扩增哺乳动物、寄生虫、节肢动物和细菌的核酸。该鸟类内源性内部控制系统灵敏度高（单拷贝/反应体系）、特异性强（仅扩增鸟类的核酸）。
2.一种基于HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统的应用
按照制定相同的采样方法、样品保存液和运输方式，不同采样者从五个省份（江苏、云南、山东、福建、湖北）和西藏自治区的活禽市场中，采集415份禽类的咽喉样本，用于两种病原体（禽流感病毒、衣原体）和粘菌素耐药基因mcr-1的PCR检测，同时采用本研究建立的鸟类内源性内部控制系统，对采集样品的质量进行评价。
两种病原体和粘菌素耐药基因mcr-1在六个地区的阳性率差异性显著。云南省禽流感阳性率最高为31.4％，其次是江苏省26.1％，福建省14.7％，山东、湖北省和西藏禽流感阳性率均为0％;云南省衣原体阳性检出率最高为67.1％，其次是山东省50％，福建省29.4％，江苏省10％，湖北省1.6％，西藏0％;江苏省粘菌素耐药基因mcr-1阳性检出率最高为76.2％，其次为云南省75.7％，福建省32.8％，山东省3.4％，湖北省0％，西藏0％。
HMBS SYBR Green-qPCR方法监测结果表明:山东、江苏、云南三个省份样本中的HMBS基因的阳性率均为100％，HMBS基因的平均拷贝数分别为105.15±0.97[SD]/swab、104.59±0.35[SD]/swab和104.57±0.49[SD]/swab，相比较，来自湖北、福建省和西藏的样品中分别有2个、15个和11个未检测到HMBS基因，HMBS基因的平均拷贝数分别为103.59±0.39[SD]/swab、103.84±0.69[SD]/swab和103.01±1.11[SD]/swab，因此，不同采样者的采样方式会影响采集样本核酸的质量，进而影响病原体和耐药基因的检出率。本研究所建立的内部控制系统能够准确的监测鸟类临床样本中核酸的质量，筛选出不合格的样品，显著地降低了PCR检测的假阴性率。
3.一种基于HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统的验证
为了证明该系统能够准确的监测样本中核酸的质量，在本项研究中，用禽流感病毒感染20只SPF鸡，采用三种采样方法（充分、适中、轻微）采集咽喉拭子，采集的拭子样本保存在三种保护液（DNA/RNA核酸稳定剂、1×PBS、四种抗生素混合液）中，另外，将这些样品分别置于室温（0天，3天和9天），随后对所有样本进行HMBS SYBRGreen-qPCR检测，以及禽流感病毒的PCR检测。试验结果表明:1）充分采集的样本HMBS基因检测结果均为阳性，H9N2AIV检测出的阳性率为90％。2）适中和轻微采集样本的HMBS基因的阳性率为分别为50％和20％，H9N2AIV检测出的阳性率分别为50％和0％。在三种样本保护液中，DNA/RNA核酸稳定剂的效果最好，室温储存9天内对样本中H9N2AIV的检出率无影响，样本在另外两种保护液中室温储存3天或3天以上，对样本核酸质量和病原体阳性检出率的影响差异性显著。实验证明:采样方法、样品保护液和室温储存时间都会影响样本核酸的水平和质量，从而影响病原体阳性检出率。
综上所述，本研究所建立的HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统能够简便地、灵敏地、快速地实时监测临床样本核酸的质量，是对鸟类样本从采集，运输，保存，核酸提取，PCR检测的整个过程的监测与验证，能够实时高水平的监测鸟类临床样本的质量，为及时防控鸟类的疫情奠定基础。
1.一种基于HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统的建立
在本论文的研究一中，设计了一套针对鸟类的羟甲基胆色烷合成酶(hydroxymethylbilane synthase，HMBS)基因的SYBR Green定量PCR系统，鸟类HMBS基因是鸟类被检组织或器官自带的内参基因。本实验建立的内源性内部控制系统可特异性扩增8种鸟类（鸡、鸭、鹅、鸽子、大雁、天鹅、鹳鹤、鹌鹑）咽喉拭子的核酸、鸡的11种组织或器官、7种中国地方品种鸡（青壳蛋鸡、琅琊白条、芦花鸡、如皋黄鸡、仙居鸡、胡须鸡、青光鸡、白耳鸡、高居鸡）血样的核酸，而不会扩增哺乳动物、寄生虫、节肢动物和细菌的核酸。该鸟类内源性内部控制系统灵敏度高（单拷贝/反应体系）、特异性强（仅扩增鸟类的核酸）。
2.一种基于HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统的应用
按照制定相同的采样方法、样品保存液和运输方式，不同采样者从五个省份（江苏、云南、山东、福建、湖北）和西藏自治区的活禽市场中，采集415份禽类的咽喉样本，用于两种病原体（禽流感病毒、衣原体）和粘菌素耐药基因mcr-1的PCR检测，同时采用本研究建立的鸟类内源性内部控制系统，对采集样品的质量进行评价。
两种病原体和粘菌素耐药基因mcr-1在六个地区的阳性率差异性显著。云南省禽流感阳性率最高为31.4％，其次是江苏省26.1％，福建省14.7％，山东、湖北省和西藏禽流感阳性率均为0％;云南省衣原体阳性检出率最高为67.1％，其次是山东省50％，福建省29.4％，江苏省10％，湖北省1.6％，西藏0％;江苏省粘菌素耐药基因mcr-1阳性检出率最高为76.2％，其次为云南省75.7％，福建省32.8％，山东省3.4％，湖北省0％，西藏0％。
HMBS SYBR Green-qPCR方法监测结果表明:山东、江苏、云南三个省份样本中的HMBS基因的阳性率均为100％，HMBS基因的平均拷贝数分别为105.15±0.97[SD]/swab、104.59±0.35[SD]/swab和104.57±0.49[SD]/swab，相比较，来自湖北、福建省和西藏的样品中分别有2个、15个和11个未检测到HMBS基因，HMBS基因的平均拷贝数分别为103.59±0.39[SD]/swab、103.84±0.69[SD]/swab和103.01±1.11[SD]/swab，因此，不同采样者的采样方式会影响采集样本核酸的质量，进而影响病原体和耐药基因的检出率。本研究所建立的内部控制系统能够准确的监测鸟类临床样本中核酸的质量，筛选出不合格的样品，显著地降低了PCR检测的假阴性率。
3.一种基于HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统的验证
为了证明该系统能够准确的监测样本中核酸的质量，在本项研究中，用禽流感病毒感染20只SPF鸡，采用三种采样方法（充分、适中、轻微）采集咽喉拭子，采集的拭子样本保存在三种保护液（DNA/RNA核酸稳定剂、1×PBS、四种抗生素混合液）中，另外，将这些样品分别置于室温（0天，3天和9天），随后对所有样本进行HMBS SYBRGreen-qPCR检测，以及禽流感病毒的PCR检测。试验结果表明:1）充分采集的样本HMBS基因检测结果均为阳性，H9N2AIV检测出的阳性率为90％。2）适中和轻微采集样本的HMBS基因的阳性率为分别为50％和20％，H9N2AIV检测出的阳性率分别为50％和0％。在三种样本保护液中，DNA/RNA核酸稳定剂的效果最好，室温储存9天内对样本中H9N2AIV的检出率无影响，样本在另外两种保护液中室温储存3天或3天以上，对样本核酸质量和病原体阳性检出率的影响差异性显著。实验证明:采样方法、样品保护液和室温储存时间都会影响样本核酸的水平和质量，从而影响病原体阳性检出率。
综上所述，本研究所建立的HMBS SYBR Green-qPCR的鸟类DNA内源性内部控制系统能够简便地、灵敏地、快速地实时监测临床样本核酸的质量，是对鸟类样本从采集，运输，保存，核酸提取，PCR检测的整个过程的监测与验证，能够实时高水平的监测鸟类临床样本的质量，为及时防控鸟类的疫情奠定基础。