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研究背景:多酚类化合物2,4’,5’-三羟基-5,2’-二溴二苯甲酮（LM49）是课题组前期通过对海洋来源活性多酚类先导化合物进行结构优化获得的高活性新结构化合物,该化合物对H2O2导致的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤及脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）导致的人脐静脉细胞（EA.hy926）损伤有很强的保护作用;LM49具有显著的抗大鼠心肌缺血再灌注损伤、抗大鼠动脉粥样硬化、保护大鼠糖尿病肾损伤以及保护大肠杆菌诱导的大鼠急性肾盂肾炎肾损伤等多种体内活性。LM49在以上实验中均表现出可抑制炎症反应,减少炎性因子分泌以及增加急性肾盂肾炎模型大鼠血中CD4+T细胞比例的作用。根据前期研究结果我们推测LM49的药理活性可能与其发挥抗炎作用和能调节机体免疫应答反应相关,但具体作用及其机制尚不清楚。目的:本论文旨在以高活性多酚化合物LM49为研究对象,运用细胞和分子生物学技术,以非特异性免疫细胞（巨噬细胞）和特异性免疫细胞（小鼠脾脏淋巴细胞）为靶细胞,研究其对特异性和非特异性免疫细胞反应的作用及对LPS诱导的急性肝脏损伤小鼠的肝保护作用,探讨其抗炎免疫活性作用及机制。方法:一、多酚化合物LM49对RAW264.7巨噬细胞抗炎免疫调节的活性影响以MTT法检测LM49对RAW264.7细胞活力的影响,确定实验中LM49的浓度;Griess法检测LM49对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO分泌的影响;流式细胞术检测LM49对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活性氧（ROS）的影响;流式细胞术检测LM49对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞吞噬FITC-dextran的影响;激光共聚焦检测LM49对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞内线粒体的影响;ELISA检测LM49对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-10和TNF-α表达的影响。从分泌细胞因子、细胞毒因子及吞噬作用等方面研究LM49对巨噬细胞具有免疫调节活性。二、LM49对RAW264.7巨噬细胞抗炎免疫调节机制研究RT-PCR检测LM49对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6、TNF-α和iNOS mRNA表达的影响;Western-blot检测LM49对LPS诱导的RAW264.7细胞PI3K/AKT信号通路中PI3K、p-AKT和AKT蛋白表达的影响及使用PI3K/AKT信号通路抑制剂后PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达影响;RT-PCR检测PI3K抑制剂LY294002对LM49作用的RAW264.7细胞NO释放,IL-6、TNF-α、和IL-10 mRNA的影响以及流式细胞术检测PI3K抑制剂LY294002对LM49作用的RAW264.7细胞吞噬FITC-dextran的影响。三、LM49对小鼠脾脏淋巴细胞免疫调节的活性影响流式细胞术鉴定磁珠分选的小鼠T、B淋巴细胞纯度;MTT法检测LM49对小鼠T、B淋巴细胞活力的影响;流式细胞术检测LM49对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响以及LM49对小鼠T、B淋巴细胞亚群的影响;ELISA法检测LM49对小鼠T淋巴细胞细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的影响以及LM49对小鼠B淋巴细胞分泌免疫球蛋白IgG的表达;流式细胞术检测LM49对小鼠T淋巴细胞胞内因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的影响。四、LM49对小鼠T淋巴细胞免疫调节机制研究RT-PCR法检测LM49对小鼠脾T淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γmRNA表达的影响及LM49对小鼠脾T淋巴细胞核转录因子T-bet、GATA-3、RORγt及FoxP3基因表达的影响;Western-blot检测LM49对小鼠脾T淋巴细胞MAPK信号通路相关蛋白:p-ERK1/2,ERK1/2,p-JNK,JNK,p-p38 and p38的影响以及给予MAPK信号通路抑制剂后对小鼠脾T淋巴细胞MAPK信号通路相关蛋白表达的影响;RT-PCR法检测LM49及MAPK信号通路抑制剂对对小鼠脾T淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γmRNA表达的影响;流式细胞术检测LM49及MAPK信号通路抑制剂对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响。五、LM49对急性肝损伤小鼠的抗炎及免疫调节作用LM49对急性肝损伤小鼠脏器指数的影响;ELISA检测LM49对急性肝损伤小鼠肝损伤指标AST、ALT以及细胞因子IL-6、TNF-α和IL-10的影响的影响;免疫组化法检测LM49对急性肝损伤小鼠肝脏病理切片的影响;流式细胞术检测LM49对急性肝损伤小鼠脾脏淋巴细胞亚群以及T淋巴细胞胞内因子的影响。结果:1.LM49能显著降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞细胞毒分子NO和ROS的产生,降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-6的生成,升高抑炎因子IL-10的生成,具有明确的剂量依赖性;LM49可能是通过增加小鼠RAW264.7巨噬细胞内线粒体数量从而增加巨噬细胞的吞噬能力。2.LM49可明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞细胞中IL-6和TNF-αmRNA的表达,上调IL-10 mRNA的表达,具有明确的剂量依赖性;LM49（15μM）可显著增加PI3K/Akt信号通路相关蛋白Akt及p-Akt蛋白表达水平;PI3K抑制剂LY294002可明显降低PI3K/Akt信号通路中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的表达,且增加NO的产生、IL-6和TNF-αmRNA的水平,降低IL-10 mRNA的水平;PI3K抑制剂LY294002显著降低了LM49影响巨噬细胞对FITC-dextran的摄取。3.LM49（10、15μM）与ConA协同可明显促进小鼠脾T淋巴细胞增殖;LM49（15μM）可显著提高小鼠脾淋巴细胞CD3+CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+的比值;LM49（15μM）可显著促进T淋巴细胞分泌Thl型细胞因子IL-2和Th2型细胞因子IL-4、IL-10,但不影响B淋巴细胞分泌IgG分泌水平。4.LM49（15μM）可明显增加T-bet和GATA3的mRNA水平,降低了Foxp3和RORγt的水平;LM49（10、15μM）明显增加了MAPK通路相关蛋白ERK1/2,p-ERK1/2和p-JNK的表达水平;LM49（10μM）明显增加了p-p38的表达水平;特异性抑制剂PD-98059、SP-600125、SB-203580相继阻断MAPK通路后,明显减少了IL-2、IL-4和IL-10的mRNA表达,增加了IL-17mRNA表达,而不改变IFN-γmRNA的水平;特异性抑制剂明显抑制LM49增加的T淋巴细胞的增殖,其中ERK1/2抑制剂PD-98059组抑制T淋巴细胞增殖作用最明显。5.LM49显著提高了急性肝损伤小鼠脾脏的脏器指数,具有剂量依赖性;LM49可明显降低LPS刺激升高的IL-6、TNF-α、AST和ALT的水平,具有剂量依赖性;HE染色结果显示明LM49可改善急性肝损伤小鼠的肝组织病变;LM49高剂量组（40.5 mg/Kg）显著提高了急性肝损伤小鼠脾脏淋巴细胞CD3+CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+的比值;LM49高剂量组明显增加T细胞胞内因子IL-2、IL-4及IL-10的分泌;LM49明显降低IL-17的分泌,具有一定剂量依赖性。结论:1.LM49对小鼠巨噬细胞具有抗炎免疫调节活性。LM49抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,与调控PI3K/AKT炎症信号通路有关。2.LM49对小鼠脾T淋巴细胞具有免疫调节活性。LM49对CD4+T淋巴细胞的免疫调节作用,与调控MAPK通路有关。3.LM49对LPS诱导的急性肝损伤小鼠具有显著的肝脏保护作用,可能通过明显提高小鼠脾脏指数、调节小鼠淋巴细胞亚群以及维持Th1/Th2/Th17的平衡等方面发挥其抗炎免疫作用。