在欧美国家,前列腺癌是一种非常普遍的男性恶性肿瘤,死亡率在男性疾病中位居第二位,仅次于肺癌。近年来,随着人们对疾病的认识和诊断技术的不断发展,亚洲国家的前列腺癌发病率也在提高,且发病年龄正趋于年轻化。对于早期前列腺癌,放疗和手术治疗是潜在的根治模式。对于晚期的前列腺癌病人,也可以用去势的方法治疗,这样可以使大于90%的病人病情得到缓解。然而,大多数这样的前列腺癌患者都会在治疗后1～3年内复发。在这个阶段,前列腺癌不再是雄激素依赖型的了,而是变成了一种雄激素或者是性激素非依赖或抵抗的前列腺癌。这种性激素非依赖型的前列腺癌对激素抑制治疗和化疗无效,细胞继续生长,肿瘤停止退化,病人生存率非常低。所以,急切期待着新的治疗模式的产生。　　 免疫治疗策略治疗恶性肿瘤是一种很有希望的的治疗模式。其中,NK细胞是一类能够介导细胞毒性对抗肿瘤细胞和病毒感染的淋巴细胞亚群。它是天然免疫系统的一个关键组成部分,NK细胞具有各种杀伤途径的组成成分以杀伤靶细胞,包括释放细胞毒性颗粒、产生细胞因子,而这些细胞因子能够诱导免疫反应,并能在靶细胞表面连接死亡受体。值得注意的是,NK细胞具有TRAIL和Fas配体(FasL),它们都能在靶细胞上触发凋亡。NK细胞识别靶点是被激活信号和抑制信号的动态平衡来调节的。抑制性受体主要是杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer-cell Immunoglobulin-liker recptors,KIRs),可以特异性的和自身细胞表面的HLA-I类分子结合,从而抑制由活化性受体激发的细胞毒性作用,使自身细胞免受NK细胞的攻击。尽管存在一个激活性受体,抑制性配体也能够引发一些优先信号,抑制NK细胞的机能。自体的HLA分子使NK细胞失活是恶性肿瘤细胞逃逸宿主NK细胞介导的免疫的一个潜在机制。　　 26S蛋白酶体是一种复杂的酶类,在所有的真核细胞胞核和胞浆中表达,通过泛素连接来降解靶蛋白。蛋白酶体能够调节细胞内的蛋白水解、清除错配和不需要的蛋白、控制细胞循环调节蛋白、转录因子、和已确定的抑癌和癌基因的细胞内水平,对维持内环境的稳定起了重要作用。这些作用使它成为了一种有潜力的肿瘤治疗靶点。硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂,它曾经被批准用于多发性骨髓瘤的治疗。现在正被研究作为单药或者与化疗药物联合用于其它癌症的治疗。蛋白酶体的抑制伴随着减少肿瘤细胞的增殖和增加凋亡。　　 FAK是一个非受体蛋白酪氨酸激酶,定位于细胞间的连接和粘附位点。它调节很多细胞功能,如细胞粘附,迁移,扩散和凋亡。FAK的激活和它的下游信号通路广泛参与了复杂的间质和上皮恶性肿瘤的进展。在很多恶性肿瘤中,FAK的表达都有所增加,包括结直肠癌、乳腺癌、肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经细胞瘤和肝细胞癌等。整合素介导了FAK的激活,FAK的Tyr397位点发生自主磷酸化,从而增强FAK的下游信号通路。通过Tyr-397的自体磷酸化激活的FAK导致了肿瘤的进展,同时高度参与了肿瘤的迁移和侵袭。因此,FAK在肿瘤的进展上扮演了一个重要的角色,而且也是抗肿瘤药物治疗的一个重要的分子靶点。　　 本课题以激素依赖性的前列腺癌细胞株LNCaP和激素非依赖性的前列腺细胞株DU145为模型,研究硼替佐米增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性作用,并探讨其机制。以及硼替佐米对FAK的影响,及其对前列腺癌细胞迁移和侵袭的作用。为防治前列腺癌提供新思路和新靶点。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、细胞株　　 前列腺癌细胞株DU145、LNCaP购于中国医学科学院基础医学研究所。　　 2、组织标本　　 外周血采集自健康成人志愿者。　　 二、主要研究方法　　 1、人外周血NK细胞的分离纯化及检测　　 取健康志愿者外周血20ml,提取外周血单个核细胞(PBMCs),用NK分离试剂盒,分离NK细胞,流式细胞术检测NK细胞的纯度;纯化的NK细胞用CD3和CD56染色,CD3-CD56+的细胞为NK细胞,纯化的细胞中NK细胞占85%以上。　　 2、CCK-8法测定细胞增殖能力和NK细胞的杀伤能力。　　 3、膜联蛋白(Annexin-V)和碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(flow cytometry,FCM)定量检测细胞凋亡率。　　 4、流式细胞术检测DR5、Fas、HLA-ABC蛋白的表达。　　 5、Real-time PCR检测DR5、Fas、HLA-CmRNA表达。　　 6、Transwell法测定细胞迁移能力。　　 7、Matrigel小室测定细胞侵袭能力。　　 8、Western blot检测FAK、Tyr397蛋白的表达。　　 9、统计学处理:每次实验重复3次,采用SPSS11.5统计软件包对数据进行统计分析,数据结果以-x±s表示,以P＜0.05为判断差异显著性标准。　　 结果：　　 1、不同浓度硼替佐米作用DU145和LNCaP细胞24、48、72h,CCK.8法检测细胞的增殖率,结果发现在用15或20nmol/L的硼替佐米孵育48小时后显著降低了DU145和LNCaP细胞的增殖活性。　　 2、不同浓度硼替佐米作用DU145和LNCaP细胞24h后,Annexin-V/propidium iodide法分析细胞的凋亡情况。结果显示在用15nmol/L或更高浓度的硼替佐米处理后,DU145细胞显示了一个轻度的,但是很明显的凋亡增加。而LNCaP细胞在20nmol/L或更高浓度的硼替佐米处理后,才会出现显著的凋亡。　　 3、DU145和LNCaP细胞暴露于不同浓度(0、10、20nmol/L)硼替佐米48小时后,与特定效靶比的NK细胞共培养24小时,用CCK-8法分析细胞的杀伤情况。在这个短效分析中,没有观察到硼替佐米显著的增加NK细胞介导的细胞溶解。长效分析中,特定效靶比的NK细胞与硼替佐米预处理后的DU145和LNCaP细胞共培养6天后,Annexin-V/propidium iodide法分析凋亡情况,结果显示NK细胞作用后显著增加了肿瘤细胞的凋亡率,且在DU145细胞中的效果比LNCaP细胞显著。　　 4、DU145和LNCaP细胞暴露于不同浓度的硼替佐米24小时后,Real-time PCR法分析DR5和Fas和HLA-C基因mRNA的表达水平。结果发现随着硼替佐米浓度的增加,DUl45细胞显示了很明显的DR5和Fas基因表达水平的增加和HLA-C基因mRNA的降低。但是这些基因在LNCaP细胞中却只显示了非常微小的改变。　　 5、DU145和LNCaP细胞在正常条件下培养或用20nmol/L硼替佐米处理24小时后,用流式细胞仪分析DR5、Fas和HLA-ABC蛋白在细胞表面表达水平。结果显示用硼替佐米处理后,上调了DU145细胞表面DR5和FaS的表达水平,下调了HLA-ABC的表达水平。相对地,这三个蛋白在LNCaP细胞表面均无表达。　　 6、不同浓度的硼替佐米处理DU145细胞24小时,采用Transwell小室观察硼替佐米对DU145细胞运动性的影响,结果发现,硼替佐米抑制了DU145细胞的细胞迁移。Matrigel侵袭小室检测发现硼替佐米抑制了DU145细胞的侵袭。　　 7、Western blot法检测硼替佐米处理DU145细胞后,FAK和Tyr397蛋白表达的变化。检测发现0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L的硼替佐米处理DU145细胞24小时后,FAK总蛋白无明显变化,而Tyr397蛋白表达明显被抑制。　　 结论：　　 1、硼替佐米抑制了DU145和LNCaP细胞的增殖,增加其凋亡率。　　 2、在长效分析中,硼替佐米能显著致敏NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,但在短效分析中却没有观察到。而且这些影响在雄激素非依赖性的前列腺癌细胞DU145中更明显。　　 3、硼替佐米能显著增加雄激素非依赖性的前列腺癌细胞DU145的DR5和Fas mRNA和蛋白表达水平,而下调了HLA-ABCmRNA和蛋白的表达水平。从而增加了NK细胞的杀伤效应。而在雄激素依赖性的前列腺癌细胞LNCaP中却没有变化。　　 4、硼替佐米能抑制DU145细胞的迁移和侵袭。　　 5、硼替佐米能够抑制Tyr397蛋白表达,而对FAK总蛋白无明显影响。