研究背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势。化疗耐药是晚期患者治疗失败的主要原因，目前还缺乏有效的应对手段。化疗耐药的机制非常复杂，其中肿瘤干细胞导致化疗耐药是近年来研究的热点。 肿瘤干细胞学说认为，肿瘤组织中存在一群比例很小但具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，称之为肿瘤干细胞或肿瘤启动细胞(Tumor stem cells，or Tumor—Initiating cells)，是肿瘤形成的动力和根源。既往研究发现，肿瘤干细胞对化疗具有天然的耐受性。其耐药机制尚未完全清楚，可能包括ABC转运蛋白(ATP—binding cassette)高表达、细胞处于GO期、抗凋亡能力增强等。既往针对一些耐药机制所进行的逆转肿瘤耐药的尝试未取得令人满意的效果，因此探索新的靶点和逆转药物是目前研究的方向。 最近的研究显示细胞周期检测点的激活和DNA损伤修复能力的增强可能是某些肿瘤干细胞耐药的重要机制。化疗药物介导的DNA损伤激活细胞周期检查点Chkl(checkpoint kinase1)和Chk2(checkpoint kinase2)，进而诱导细胞周期停滞和DNA损伤修复。根据文献报道，Chk2的激活在此过程中尤为重要。因为乳腺癌干细胞(或称乳腺癌启动细胞)对化疗具有耐受性，本研究探讨此化疗耐受性与细胞周期检测点特别是Chk2的激活和DNA修复能力的增强是否相关。 研究目的： (1)探讨乳腺癌干细胞的化疗耐受性是否与Chk2异常激活相关。 (2)观察干预Chk2激活后对乳腺癌干细胞的DNA损伤修复能力和化疗耐受性的影响。 材料和方法： 1.材料 1) MCF—7及其耐药株MCF—7/ADM细胞株购于中山大学病理学教研室 2)主要试剂及仪器：1640培养基、DMEM—F12培养基、胎牛血清均来自美国Gibco公司，MTT、DMSO、Hoechst33342、Chk2 IinhibitorⅡ来自Sigma公司，阿霉素(深圳万乐药业公司)，兔抗人p—Chk2(Thr68)(Cell Signaling Technology)，单细胞凝胶电泳试剂盒(Cell Biolab)，FACSAsia流式细胞仪(美国Becton Dickinson)，Wellscan MK3酶标仪(Labsystem Dragon，美国)，CO2恒温培养箱(意大利 JOUAN公司)。 2.方法 用球囊培养、S—P(Side—Population)侧群分析、流式检测CD44+CD24-细胞比例3种方法检测MCF7及MCF—7/ADM细胞株中乳腺癌干细胞的含量；MCF—7/ADM细胞株进行悬浮培养获取乳腺癌干细胞；在MCF—7/ADM球囊细胞(代表乳腺癌干细胞)和贴壁细胞(代表分化的癌细胞)中分别用MTT法、Western—blot、彗星实验(单细胞凝胶电泳)测定两种细胞对阿霉素的耐受性、p—Chk2(第68位苏氨酸残基，Thr68)的表达、化疗作用下DNA损伤及修复情况；Annexin V和7-AAD双染法检溯阿霉素作用下球囊细胞的凋亡；Chk2抑制剂存在的情况下球囊细胞的化疗耐受性、DNA损伤修复能力、凋亡情况。所有数据统计用SPSS13.0统计软件完成。 结果： 1)MCF—7及MCF—7/ADM球囊形成率分别为1.03±0.15％和10.27±0.64％；S—P侧群比例分别为0.39±0.11％和9.60±0.66％；CD44+CD24-细胞所占比例分别为3.70±0.53％和64.87±3.87％。MCF—7/ADM细胞株含有更高含量的乳腺癌干细胞，差异均具有统计学意义(以上p均<0.05，n=3)。 2)阿霉素浓度为1，2，5，10μg/ml时MCF—7/ADM球囊细胞的存活率明显高于贴壁细胞(p<0.001，n=3)；在阿霉素浓度为0.05，0.5μg/ml时存活率无明显差别(P>0.05，n=3)；在Chk2抑制剂存在时各浓度组细胞存活率差异均无统计学意义。 3)MCF—7/ADM球囊细胞有明显的p—Chk2(Thr68)表达，在化疗作用下表达上调；贴壁细胞在有或者没有化疗药作用的情况下都没有检测到p—Chk2表达。 4)0.3μg/ml阿霉素作用24小时MCF—7/ADM球囊细胞和贴壁细胞均有明显的DNA损伤发生(指标为拖尾率、尾部DNA含量、尾矩)；经过24小时修复后球囊细胞的拖尾率、尾矩两个指标达到空白对照水平，而贴壁细胞3个指标均未能恢复；在Chk2抑制剂存在时球囊细胞3个指标都不能恢复。 5)经0.3μg/ml阿霉素作用24小时后MCF—7/ADM球囊细胞的凋亡率为10.30％±0.79％；撤药修复24小时后下降至5.93％±0.91％；在Chk2抑制剂存在时修复24小时后凋亡率上升至19.53％±2.2％，与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05，n=3)。 结论： 1)MCF—7/ADM细胞株悬浮培养可获取乳腺癌干细胞。 2)乳腺癌干细胞具有更强的化疗耐受性和DNA损伤修复能力。 3)乳腺瘸干细胞的化疗耐受性与Chk2的异常激活有关。 4)干预Chk2对靶基因的激活可以使乳腺癌干细胞DNA损伤修复能力降低，并使其化疗敏感性增强。