人血清白蛋白在毕赤酵母中的高效表达与纯化研究

来源 :中国医药工业研究总院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wudixuejie
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作为现如今用药量最大的蛋白制剂,人血清白蛋白(HSA)在近几十年的临床治疗中发挥了各种各样的作用。目前,HSA的生产工艺以人体血浆为原材料,以低温乙醇沉淀法为主要生产手段。但人体血浆自身的供应缺口、极其复杂的血浆来源以及血液病毒经药传播的风险,都严重限制了HSA的产业化生产。经过数十年的努力,科研人员成功的使用多种表达系统实现了重组人血清白蛋白(rHSA)的表达。由于具备多个显著优势,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)展现出诱人的潜能,其HSA的最高表达量已达到11 g/L。然而,相关研究均存在一个共同的难题,即甲醇的诱导时间过长(普遍超过200个小时),直接导致rHSA生产效率的低下,且大量甲醇的长时间存放也成为一个令人担忧的安全隐患。为提高rHSA的生产效率,本研究克隆hsa基因并成功在毕赤酵母GS115系统中实现了rHSA的表达。通过组氨酸自养型筛选和高浓度遗传霉素抗性筛选,本研究获得了一株表达效率较高的菌株,其在摇瓶中经过96个小时的诱导,可表达出585 mg/L的rHSA。通过诱导温度、pH和甲醇剂量的优化,rHSA的表达量上升至1.2 g/L。随后,通过进一步添加1 g/L丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、0.5%酪蛋白水解物和10 mM维生素C,rHSA的表达量又提升至1.6 g/L。本研究同时发现,在不添加任何辅助表达物而仅通过对BMGY/BMMY培养基的简化,也可以使rHSA的表达量从1.2 g/L上升至1.7 g/L。随后,本研究在5 L发酵罐水平对生产菌株的生产性能进行探索,结果表明经典恒速补料策略优于溶氧反馈补料策略,前者可在诱导96小时后实现8.86 g/L rHSA的高表达量,对应的rHSA生产效率为92.29 mg/(L*h)。最终,通过亲和层析与疏水层析的结合,本研究获得了纯度超过99.67%的rHSA,总回收率约为40%。本研究展示了毕赤酵母作为一个优秀的外源蛋白表达系统,其对重组人血清白蛋白较好的生产性能。本研究实现了较高的8.86 g/L rHSA表达量,且据我们所知,本研究首次实现了高达92.29 mg/(L*h)的rHSA生产效率。较高的生产效率结合已建立的相关分离纯化工艺,本研究为人血清白蛋白的产业化生产奠定了良好基础。
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