PRV间接ELISA方法的建立及不同免疫方案对猪伪狂犬病免疫效果的研究

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jack0418
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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种高度接触性传染病。该病毒属于嗜神经性α疱疹病毒,没有特定宿主嗜性,可感染多种哺乳动物,使其产生严重的临床症状或导致其急性死亡。猪作为PRV的天然宿主,各个年龄段的猪均可被感染,尤其是成年猪,其隐性感染后可长期带毒、排毒,给PRV的防治带来巨大困难。尤其在2011年末,PRV变异毒株的流行,致使规模化养猪场再次出现PRV爆发的趋势。因此本试验采用分离株PRV JZ-45自制油乳剂灭活苗和商品化HB-98(TK-/g G-)弱毒苗,以不同免疫方案免疫SPF级昆明雌鼠,然后用PRV间接ELISA、中和试验对小鼠血清PRV抗体水平和中和抗体效价进行检测;并在免疫后第28 d用PRV JZ-45毒株对小鼠进行攻毒试验,从而探索出更合理的免疫方案,为有效预防PRV的感染和传播提供理论支持。本试验以自制鼠源PRV高免血清(血清效价1:128000)为参照阳性血清,以超速离心纯化后的PRV JZ-45病毒液为包被抗原,建立PRV间接ELISA检测方法。具体方法如下:抗原最佳包被量为5μg/m L,37 2h+4包被过夜,用1%BSA封闭2 h后,将待检和对照血清按1:40稀释后加入酶标孔(100μL/孔),37条件下孵育1 h;酶标二抗按1:6000稀释后加入酶标孔(100μL/孔),37孵育1 h;TMB双组分显色液作用时间为15 min;然后加入终止液(50μL/孔)终止反应,读取并分析OD450值。用该方法检测30份鼠源阴性血清,根据统计学计算出其Cut-off值为0.406,检测PRRSV、PCV2、MHV阳性血清,结果均为阴性,检测PRV参照阴性、阳性血清,其变异系数均小于8%,与上海舒话生物科技有限公司小鼠(Mouse)伪狂犬病毒g B抗体(PRV-g B-AB)ELISA检测试剂盒比较,其总体符合率为91.25%。证明该方法具有良好的特异性、稳定性和准确性,即该方法建立成功。采用分离株PRV JZ-45制备油乳剂灭活苗,然后与商品化HB-98(TK-/g G-)弱毒苗以不同免疫方案免疫SPF级昆明雌鼠,在0、7、14、21、28、35和42 d采集其血液分离血清,用PRV间接ELISA与中和试验检测小鼠血清PRV抗体水平与中和抗体效价。结果显示:单次免疫情况下,JZ-45灭活苗、HB-98弱毒苗免疫组小鼠血清PRV抗体水平及中和抗体效价在0~28 d呈持续上升趋势,随后开始逐渐下降,且HB-98弱毒苗免疫组PRV抗体水平与中和抗体效价要高于JZ-45灭活苗免疫组;对联合免疫与加强免疫组对比发现JZ-45/JZ-45(两次均免灭活苗)、JZ-45/HB-98(首免灭活苗,二免弱毒苗)、HB-98/JZ-45(首免弱毒苗,二免灭活苗)和HB-98/HB-98(两次均免弱毒苗)免疫组小鼠血清PRV抗体水平及中和抗体效价在0~42 d呈持续上升趋势,且HB-98/JZ-45免疫组小鼠血清PRV抗体水平及中和抗体效价高于其它免疫组。将分离株PRV JZ-45病毒液倍比稀释(10~0-10-4)测其LD50,然后对免疫后第28 d的小鼠进行攻毒试验(剂量:100个LD50,100μL/只)。结果显示:PRV JZ-45毒株的LD50为10-2.681/0.1m L;单次免疫情况下HB-98弱毒苗保护效果优于分离株PRV JZ-45灭活苗,但PRV JZ-45、HB-98单次免疫组小鼠脾脏、脑部以及其它脏器等均有不同程度病理损伤,且脏器中病毒检出率较高;JZ-45/JZ-45、JZ-45/HB-98、HB-98/JZ-45和HB-98/HB-98联合免疫与加强免疫组小鼠在攻毒后0~14d间无明显临床症状,保护率均为100%,且器官病理变化轻微,脏器中病毒检出率较低;尤其是HB-98/JZ-45免疫组小鼠,其脑部、肾脏无明显炎症反应,除肾脏以外其它脏器均没有检测到病毒,表明联合免疫与加强免疫对小鼠有明显的保护作用,尤其是HB-98/JZ-45免疫组保护效果要优于其它的免疫组。
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