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骨骼肌正常发育是机体维持一系列重要生命活动的基础,而成肌细胞的增殖与分化是骨骼肌发育的关键环节,因此研究成肌细胞增殖与分化的调控网络是发育生物学的热点研究领域。成肌细胞的增殖与分化受到一系列转录因子以及mi RNAs的调控。miRNAs一类长度为18-22nt的非编码小RNA,其通过与靶mRNA结合来下调靶基因表达,进而参与多种生物学过程的调控。诸多研究表明,miRNAs在骨骼肌发育过程中起到重要的调控作用。基于实验室前期对大通牦牛胎牛和成年牦牛背最长肌mi RNAs高通量测序,发现mi R-487b和miR-433在牦牛胎牛背最长肌中的表达极显著高于成年牦牛,推测这两个miRNAs可能参与调控骨骼肌的生长发育。因此本研究将小鼠成肌细胞系(C2C12)作为细胞模型,来探究miR-487b和miR-433在成肌细胞增殖和分化过程中的作用,为进一步完善骨骼肌发育调控网络提供理论依据。本研究通过转染miRNA mimics或inhibitor实现miRNAs的过表达或抑制表达,研究牦牛mi R-487b和miR-433在C2C12细胞增殖与分化过程中的功能。运用双荧光素酶报告基因验证PITX2是miR-487b的直接靶基因,进一步阐明miR-487b在骨骼肌发育过程中的调控机制。主要结果如下:(1)克隆测序获得牦牛miR-487b和mi R-433成熟序列,保守性分析发现,miR-487b和miR-433成熟序列在各物种间高度保守。小鼠组织表达谱结果显示,miR-487b和mi R-433在骨骼肌中表达丰度最高。(2)miR-487b和miR-433在C2C12细胞增殖阶段表达量逐渐上调。过表达miR-487b和miR-433后,增殖标记基因PCNA、CCNB1和MKI67 mRNA表达量显著增加,PCNA蛋白表达量也显著提高。CCK-8法检测后发现,与对照组相比,过表达miR-487b和miR-433组均能显著促进细胞增殖。相反,抑制miR-487b和miR-433后,PCNA、CCNB1和MKI67表达量下调,且C2C12细胞增殖活性显著降低。表明miR-487b、miR-433促进C2C12细胞增殖。(3)体外成功构建C2C12成肌细胞诱导分化体系,随着诱导分化时间延长,miR-487b和miR-433表达量呈上升趋势。过表达miR-487b和miR-433后,分化标志基因MYOD、MYOG、MYHC在mRNA和蛋白水平均显著降低。相反,抑制miR-487b、miR-433表达后,MYOD、MYOG、MYHC在转录和蛋白水平上升。表明miR-487b、miR-433抑制C2C12细胞分化。(4)在线预测软件发现PITX2是miR-487b一个潜在的靶基因。双荧光素酶报告基因验证了miR-487b可能通过靶向PITX2的3’UTR抑制其表达,进而参与骨骼肌生长发育的调控。