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实验一新型大鼠脊髓完全横断缺损模型的建立目的采用自制的双刃显微剪刀建立大鼠脊髓完全横断缺损模型,并通过与常规造模方法比较,探索这种新模型的可行性。方法成年雌性SD大鼠42只,随机分为A组(11=6)、B组(n=18)和C组(n=18),A组仅行椎板切除；B组用尖刀在己显露脊髓的中间位置横向切断脊髓,刀尖要触及椎管前壁和侧壁骨面,反复切割,制备脊髓完全横断模型；C组采用自制双刃显微剪刀制备脊髓完全横断模型,用一钝头小钩将手术缝线从己显露脊髓的腹侧穿到对侧,轻微抬起脊髓,用双刃显微剪刀将脊髓、硬脊膜及血管一次性全部切除。造模术后使用行为学、组织学及荧光示踪的方法评价此模型的均一性。结果A组术前、术后BBB评分无明显变化。B、C两组大鼠：术后1周,后肢完全性瘫痪,BBB评分无差异；残端间距有显著性意义。术后4周,B、C两组大鼠后肢功能有不同程度恢复,但BBB评分无显著性差异。术后8周,B、C两组大鼠后肢运动功能评分相比有显著性意义；生物素化葡萄糖胺示踪显示：B组大鼠损伤尾侧可观察到少量被标记的轴突纤维,而C组大鼠尾侧无被标记的神经纤维。结论新型脊髓完全横断缺损造模方法可有效消除个体差异,有利于治疗效果的量化分析和研究对比。实验二丹参酮Ⅱ对大鼠脊髓横断后微血管面积的影响目的观察丹参酮Ⅱ对脊髓损伤后微血管面积的影响及对神经组织的保护作用方法成年SPF级雌性SD大鼠63只,随机分成4组。A假手术组(sham)9只,只做椎板切除；B模型组(SCI)18只：脊髓完全横断：C甲强龙组(SCI/MP)18只：术后30分钟内腹腔注射甲基强的松龙(30mg/kg)1次；D丹参酮Ⅱ组(SCI/TIIA)：腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(20mg/kg/d),术后半小时至术后7天,每日按时给药。大鼠分别于术后1w,2w,4w共3个时间点心脏灌注后收集脊髓损伤区域标本。标本做矢状位连续冰冻切片,片厚15μm,行HE染色观察脊髓组织出血、水肿及炎性反应情况；尼氏染色观察神经细胞损伤情况；血管内皮细胞免疫荧光染色观察脊髓损伤区域微血管面积,使用激光共聚焦显微镜在低倍镜下对脊髓矢状位切片进行整体观察,随后100倍镜下扫描拍摄。荧光图片用Image-Pro Plus 6.0软件进行处理,计算微血管面积,结果用SPSS 22.0统计学软件包进行统计分析。结果1、脊髓损伤后组织结构破坏,断端可见大量炎性细胞浸润,灰质中神经细胞固缩、坏死、溶解,神经纤维间隙增大。丹参酮ⅡA可降低炎性细胞浸润程度,减轻轴突溃变程度。2、脊髓损伤后前角灰质内可见神经元数量明显减少,神经元胞体形态破坏；细胞核膜裂解,正常圆形轮廓消失；胞浆内尼氏小体形态改变,体积缩小或消失。丹参酮ⅡA可保护神经组织,减轻继发性脊髓损伤程度。3、脊髓损伤后局部组织微血管数目减少,血管痉挛收缩结构异常。丹参酮Ⅱ可减轻脊髓损伤区域血管痉挛程度,促进血管再生。结论1、大鼠脊髓横断损伤后微血管网络结构破坏,脊髓损伤区域缺血改变。2、丹参酮Ⅱ可改善脊髓受损区域的血管形态,减轻血管损伤程度,促进脊髓损伤后血管新生。3、丹参酮Ⅱ可减轻脊髓继发性损伤程度。实验三丹参酮Ⅱ联合定向纤维蛋白水凝胶对大鼠脊髓损伤的修复目的观察丹参酮Ⅱ联合定向纤维蛋白水凝胶对脊髓损伤大鼠运动功能及轴突生长的影响方法成年SPF级雌性SD大鼠40只,分成4组。A假手术组(sham)10只：只做椎板切除；B模型组(SCI)10只：T8-T9水平脊髓横断缺损；C材料组(SCI/Fiber)10只：脊髓横断缺损后植入定向纤维蛋白水凝胶；D材料+中药组(SCI/Fiber/TIIA) 10只：脊髓横断缺损后植入定向纤维蛋白水凝胶,腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(20mg/kg/d),术后半小时至术后7天,每日定时给药。各组动物分别于术前,术后3d、1w、4w、8w、12w予行为学评分。术后12w,各组随机取5只大鼠,使用全功能肌电图／诱发电位仪测定各动物的运动诱发电位(motor evoked potential,MEP)。剩余大鼠心脏灌注后,收集脊髓损伤区域标本做矢状位连续冰冻切片,片厚15μm,行神经丝蛋白(neurofilament,NF)和生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)免疫荧光染色。结果1、各组大鼠BBB评分情况：术前各组大鼠BBB评分均为21分,造模术后,SCI组、SCI/Fiber组、SCI/Fiber/TIIA组降至0分,sham组在3d时即可恢复到正常水平。所有手术组大鼠在整个12w的测试期间,BBB评分都较低。术后8w开始,SCI/Fiber/TIIA组大鼠BBB评分开始SCI/Fiber组、与SCI组产生差异,术后12w,SCI/Fiber/TIIA组大鼠BBB评分达到12分左右,而SCI组、SCI/Fiber组在8-9分左右。2、术后12w各组大鼠运动诱发电位结果：sham组可引出正常波形,且波形稳定,形态规则,其余各手术组大鼠MEP波幅明显降低。SCI组运动诱发电位的潜伏期较sham组延长,波幅降低,波形紊乱。SCI/Fiber组与SCI组相比潜伏期缩短,差异具有统计学意义；SCI/Fiber组波幅虽然较SCI组增高,但差异无统计学意义。SCI/Fiber/TIIA组波形相对规则、稳定,潜伏期较SCI组、SCI/Fiber组明显缩短,波幅增高,差异具有统计学意义。3、免疫荧光结果：(1)术后12w,3个手术组大鼠脊髓组织矢状位切片后行GAP-邻免疫荧光染色,神经纤维被抗GAP-43标记显示为红色。SCI组大鼠仅可在损伤头端观察到阳性染色,且生长杂乱,无规则。SCI/Fiber组大鼠损伤区域头端及损伤区域中心可观察到阳性染色,神经纤维走行方向与脊髓长轴平行。SCI/Fiber/TIIA组大鼠在损伤区域的头端、中心及尾端都可观察到阳性染色神经纤维,且神经纤维走行方向与脊髓长轴平行。(2)术后12w,3个手术组大鼠脊髓组织矢状位切片后行NF免疫荧光染色,神经纤维被抗NF标记显示为绿色。各组组大鼠损伤区域两端的正常脊髓组织可观察到染色阳性的神经纤维。SCI组大鼠损伤区域接近头端的位置也可观察到阳性染色的神经纤维,但生长杂乱无序,没有方向性。SCI/Fiber组大鼠在损伤的头端及中心可观察到与脊髓长轴平行的阳性染色神经纤维,但损伤尾端未见。SCI/Fiber/TIIA组,在损伤头端、中心及尾端都观察到了染色阳性的神经纤维,且神经纤维走行方向与脊髓长轴平行。结论1、丹参酮ⅡA联合定向纤维蛋白水凝胶可改善脊髓完全横断大鼠后肢运动功能并使其运动传导通路恢复一定的电生理性。2、丹参酮ⅡA可促进GAP-43的表达,与定向纤维蛋白水凝胶联合后可引导神经轴突规则有序的生长。3、“中药+组织工程技术”可能成为一种治疗SCI有意义的组合方案。