益肝康颗粒由丹参、黄芪、当归、赤芍、白术、茯苓、鸡内金、厚朴、柴胡9味药材组成,是依据传统中医药理论组方,采用现代工艺生产的现代中药复方制剂属6类中药新药。经临床观察,具有活血化瘀健脾的功效,用于治疗慢性肝病(炎),对慢性乙肝、抗肝纤维化治疗具有一定疗效。本研究建立了益肝康颗粒的质量标准。以丹参酮ⅡA、丹酚酸B、黄芪甲苷、芍药苷、柴胡皂苷a、当归、白术为质控指标用薄层色谱法进行定性鉴别,并以丹参酮ⅡA、丹酚酸B、黄芪甲苷、芍药苷为指标成分用反相高效液相色谱法进行了含量测定。所建方法专属性强,灵敏快速,结果准确可靠,精密度和稳定性良好,可用于控制产品质量。建立了益肝康颗粒中5种有效成分的高效液相色谱法同时测定方法,为全面控制其质量提供了方法。建立了不同批次益肝康颗粒HPLC指纹图谱,用相关软件对制剂整体质量进行评价。比较了制剂与处方药材指纹图谱,归属了主要色谱特征峰的药材来源,分析了大鼠给予益肝康颗粒后血清指纹图谱的变化,为阐明中药复方制剂的药效物质基础奠定了基础。本研究建立了益肝康颗粒质量的综合分析方法,为全面评价与控制中药复方制剂质量提供了依据。第一部分益肝康颗粒的薄层色谱鉴别方法目的:为控制益肝康颗粒质量,采用薄层色谱法对益肝康颗粒处方中的组成药味进行定性鉴别。为建立该药的质量标准奠定基础。方法:(1)鉴别药味的选择。(2)对照物的选择。(3)供试品处理方法的选择:比较不同提取方式、提取溶剂及提取时间对待测成分提取效率的影响,选择能有效排除干扰、富集待测成分的提取方法。(4)薄层色谱条件的优化:选用合适的固定相,优化展开剂的组成、配比、展开环境等影响因素,确定最佳的色谱条件。(5)显色或检视条件的确定:选用简便、可明显的显现并区别斑点的显色剂或紫外光灯。(6)进行专属性实验,确保实验结果不受益肝康颗粒中其它组成药材中化学物质的干扰。结果:(1)选取丹参、黄芪、赤芍、柴胡、当归、白术6味药的定性鉴别列入益肝康颗粒质量标准。选用的对照物分别为丹参酮ⅡA、丹酚酸B、黄芪甲苷、芍药苷、柴胡皂苷a对照品及当归、白术对照药材。对制剂中厚朴、鸡内金和茯苓的鉴别,虽采用多种样品处理手段和展开系统,但供试品在与对照药材色谱相应位置处无特异斑点,或阴性干扰较大,故未列入标准中。(2)采用确定的薄层鉴别方法进行实验,供试品在与对照品或对照药材色谱相应的位置处显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰。结论:所建方法专属性强、简便、准确,可以用于益肝康颗粒的定性鉴别,为控制制剂质量提供了可靠的方法。第二部分益肝康颗粒含量测定的方法学研究目的:为控制制剂质量,建立了益肝康颗粒中有效成分的高效液相色谱含量测定方法。方法:(1)质控指标的选择。(2)选择能有效排除干扰、富集待测成分的提取方法。(3)确定色谱条件:选用合适的色谱柱,优化流动相组成、配比及流速,使待测成分与其他峰完全分离。(4)进行方法学考察。(5)样品含量测定。结果:(1)根据益肝康颗粒的处方、制剂工艺及有关药效物质基础研究资料,选择丹参中的丹参酮ⅡA、丹酚酸B,黄芪中黄芪甲苷,赤芍中芍药苷作为质控指标进行含量测定。(2)提取条件:丹参酮ⅡA和芍药苷用甲醇超声提取20 min,可提取完全;丹酚酸B用水在冰水浴中超声20 min可提取完全;黄芪甲苷需经甲醇提取,水饱和正丁醇萃取,氨试液洗涤,过D101大孔树脂以70%乙醇洗脱等多步操作。(3)最佳色谱条件:均采用十八烷基键合硅胶为填充剂的固定相;使用等度洗脱:丹参酮ⅡA、丹酚酸B、黄芪甲苷、芍药苷的流动相分别为甲醇-水(80:20),乙腈-甲醇-0.08%甲酸水(37:111:252),乙腈-水(33:67),乙腈-0.05%磷酸溶液(18:82)。丹参酮ⅡA、丹酚酸B、芍药苷采用紫外检测器,检测波长分别为270 nm、286 nm、230 nm;黄芪甲苷采用蒸发光散射检测器,参数为漂移管温度80℃;氮气流量2.5 psi。(4)丹参酮ⅡA在0.1334~2.668μg,丹酚酸B在0.104~2.08 mg,黄芪甲苷在0.6930~13.86μg,芍药苷在2.00~40.1μg具有良好线性关系。各方法重现性良好,RSD分别小于2.3%,1.5,1.6,2.9。丹参酮ⅡA、丹酚酸B、黄芪甲苷、芍药苷加样回收率分别为100.9%,100.5%,98.0%,101.7%,RSD分别小于2.5%,2.3%,1.2%和1.1%。结论:本研究采用反相高效液相色谱法建立了益肝康颗粒中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、黄芪甲苷、芍药苷4种成分的含量测定方法。方法专属性强,灵敏快速,结果准确可靠,精密度和稳定性良好。本研究建立的方法可以用于益肝康颗粒的含量测定,作为该制剂质量控制标准。第三部分益肝康颗粒有效成分的多组分同时分析目的:采用反相高效液相色谱法建立益肝康颗粒有效成分的多组分同时分析方法,并将所建立的方法用于不同批次制剂的含量测定,为全面评价与控制益肝康颗粒的质量提供方法。方法:(1)比较不同提取方式、提取溶剂及提取时间,选择效率高的提取方法。(2)选用适宜的色谱柱和检测波长,优化流动相的组成、配比、梯度洗脱程序、柱温等影响因素,确定最佳的色谱条件。(3)进行系统适用性实验及方法学考察。(4)用建立的方法,对不同批次样品进行多组分同时测定。结果:(1)提取方法:益肝康颗粒加水超声处理10 min,再加甲醇超声处理10 min。(2)HPLC色谱条件:采用Restek PinnacleⅡC 18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。流动相A为0.1%磷酸水溶液;流动相B为甲醇-乙腈(50:50);洗脱程序为:0 ~5 min 1%B;8 min 5%B;30 min 35%B;40 min 45%B;50 min 80%B;60 min 90%B。采用DAD检测器双波长同时监测,检测波长为:芍药苷230 nm;没食子酸、丹参素、丹酚酸B和丹参酮ⅡA 270 nm。(3)没食子酸、丹参素、芍药苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA分别在31.40~376.8,452.7~5659,201.6~2520,1657~20710和54.33~679.2μg范围内呈良好的线性关系,平均回收率分别为102.5%,104.6%,99.4%,105.0%,102.9%,RSD均小于3.5%。结论:本研究采用反相高效液相色谱法建立了益肝康颗粒多组分同时分析方法。采用双波长同时监测的方式,既保证了含量测定所需的检测灵敏度,又处理方便。方法专属性强,灵敏快速、准确可靠,精密度和稳定性良好。本研究建立的方法可以用于同时测定益肝康颗粒中多个有效成分,为全面控制质量提供了简捷的分析方法。第四部分益肝康颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究目的:建立益肝康颗粒的高效液相指纹图谱分析方法,利用相似度对多批制剂整体质量进行评价;用该法比较制剂与组成药材的HPLC指纹图谱,归属制剂指纹图谱中主要色谱特征峰的药材来源;考察大鼠给予益肝康颗粒后血清指纹图谱,为阐明益肝康颗粒的药效物质奠定基础。方法:1.建立益肝康颗粒HPLC指纹图谱方法:(1)确定色谱条件及样品处理方法。(2)进行方法学考察。(3)对不同批次的益肝康颗粒进行指纹图谱分析。(4)采用相关软件对所得指纹图谱数据进行处理。2.采用所建方法对益肝康颗粒组成药材进行分析。3.大鼠灌胃给予益肝康颗粒混悬液后,取血清进行指纹图谱分析。结果:1.益肝康颗粒的HPLC指纹图谱研究:(1)提取方法:益肝康颗粒加水超声10 min,再加甲醇超声处理10 min。(2)HPLC色谱指纹图谱条件:选用C18柱;以0.1%磷酸(A)-乙腈(B)为流动相,进行梯度洗脱:0 min 2%B;10 min 10%B;25~30 min 25%B;55 min 75%B;检测波长为275 nm,流速1.0 mL/min,柱温30℃。(3)方法精密度高、重现性好,方法学各项指标均符合指纹图谱要求。(4)对10批益肝康颗粒进行了指纹图谱分析,共标定了17个共有峰,相似度在0.961~0.993之间。2.对益肝康颗粒中主要色谱特征峰进行归属,确定来源于丹参、赤芍、黄芪。3.对10批血清样品进行了测定,共标定了10个共有峰。其中7个为内源性成分,3个为代谢产物。结论:本研究建立了不同批次益肝康颗粒的HPLC指纹图谱分析方法,方法精密度和稳定性良好,为益肝康颗粒的整体质量控制提供了方法。并对益肝康颗粒中主要色谱特征峰进行分析,确定了药材归属,同时比较了益肝康颗粒血清指纹图谱,分析了给药后大鼠血清的成分变化。为阐明中药复方制剂的药效物质奠定基础。