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中老年男性睾酮(testosterone,T)水平随着年龄的增长而下降,这会增加老年男性罹患肥胖、代谢综合征、动脉粥样硬化、骨质疏松症等疾病的风险。下丘脑-垂体-睾丸轴(hypothalamus-pituitary-testis axis,HPT)对男性性激素水平具有直接调控作用,是生殖功能的神经调控中心。下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,Gn RH)神经元是控制哺乳类、啮齿类等动物生殖能力的中枢神经网络关键的输出细胞,负责整合多个内部稳态和外部环境信号,维持个体的生育能力。Gn RH神经元向下丘脑正中隆起投射,形成Gn RH脉冲释放的功能单位,负责间歇性释放Gn RH,当垂体门脉血中Gn RH浓度升高,则刺激垂体前叶分泌黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH),这是男性血清T调控的主要中枢途径。针灸疗法可以调节血清激素水平,具有延缓衰老作用,但其作用机制尚未明确。课题组前期研究结果显示,温和灸、电针可以调节衰老模型雄性大鼠血清T和游离睾酮(free testosterone,FT)水平。本课题以自然衰老雄性大鼠为研究对象,以中枢衰老与“HPT”理论为研究基础,观察温针灸、温和灸、电针对自然衰老的老年雄性大鼠血清Gn RH、LH、FSH、T、FT水平,下丘脑KISS-1/GPR54、RFRP-3/GPR147,垂体Gn RH-R,睾丸GPR54、GPR147、Gn RH-R基因与蛋白表达的影响,探讨针灸疗法调节衰老雄性大鼠血清性激素水平及延缓衰老效应的中枢调控途径。目的1.观察温针灸、温和灸、电针对自然衰老的老年雄性大鼠睾丸组织形态结构与血清性激素水平的影响。2.观察温针灸、温和灸、电针对自然衰老的老年雄性大鼠HPT生殖内分泌系统KISS-1/GPR54、RFRP-3/GPR147、Gn RH-R基因及蛋白的影响,探讨针灸疗法实现延缓生殖衰老作用的基因调控途径。方法1.检测8只SD青年大鼠(2月龄)和50只SD老年大鼠(20月龄)的血清T,计算青年大鼠血清T均值,取其95%置信区间,低于该值的老年大鼠即纳入试验。将纳入实验的40只SD老年大鼠随机分为温针灸组(warm-needling acupuncture group,WNA)、温和灸组(mild moxibustion group,MM)、电针组(electro-acupuncture group,EA)、药物组(drug-treated group,DR)、老年组(aged rat group,AR),每组8只,8只SD青年大鼠作为青年组(adult control group,AC)。温针灸组、温和灸组及电针组取双侧“肾俞”穴、“关元”穴进行治疗,1次/d,每次15 min。药物组给予腹部皮下注射丙酸睾酮(testosterone propionate,TP)注射液,7 mg·kg-1·3d-1,共治疗8周。老年组和青年组大鼠给予腹部皮下注射生理盐水,剂量、疗程与药物组相同。2.采用过碘酸雪夫氏(Periodic acid-schiff stain,PAS)染色法处理大鼠睾丸组织切片,于光镜下观察各组大鼠睾丸结构与形态改变。3.采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠血清T、FT、Gn RH、LH、FSH水平。4.采用免疫组化法检测睾丸组织中Gn RH-R的表达;免疫印迹试验(western blot,WB)检测下丘脑吻素肽(kisspeptin,Kp)、GPR54、GPR147,垂体Gn RH-R,睾丸Gn RH-R、GPR54、GPR147的蛋白表达;实时荧光定量PCR检测系统(real-time quantitative PCR detecting system,Q-PCR)检测各组大鼠下丘脑组织中KISS-1、GPR54、RF酰胺相关肽-3(RF Amide-Related Peptide-3,RFRP-3)、GPR147,垂体与睾丸组织中Gn RH-R m RNA表达。结果1.PAS结果显示,青年组大鼠睾丸细胞形状近似椭圆形,生精小管规则、无萎缩,界膜完整,各级生精细胞排列整齐有序。老年组大鼠睾丸组织PAS染色呈阳性,基膜增厚,广泛性生精小管退行性萎缩,生精细胞严重脱落,部分生精小管仅剩下精原细胞和支持细胞,睾丸间质细胞(leydig cell,LC)退化,萎缩。在温针灸、温和灸、电针、药物组中睾丸细胞病理变化程度低于老年组大鼠,药物组大鼠出现睾丸LC数量减少。2.ELISA结果显示,与青年组相比,老年组大鼠血清T、FT、Gn RH水平显著降低(均P﹤0.05),与老年组相比,温针灸、温和灸、电针、药物组大鼠血清T、FT、Gn RH水平明显升高(均P﹤0.05),且温针灸组Gn RH水平显著高于药物组(P﹤0.05),各组大鼠血清LH、FSH水平差异无统计学意义(均P﹥0.05)。3.免疫组化结果显示,在睾丸LC中有明显的Gn RH-R免疫反应,而在生精细胞中未见Gn RH-R免疫反应,阳性细胞呈弥漫性胞质染色。与青年组相比,老年组大鼠睾丸组织中的Gn RH-R阳性细胞数明显减少。平均积分光密度(integral optical density,IOD)分析显示,老年组大鼠睾丸细胞Gn RH-R的染色免疫反应性低于温针灸、温和灸、电针和药物组(P﹤0.05)。WB、Q-PCR结果显示,与青年组相比,老年组大鼠下丘脑组织中Kp、GPR54、GPR147蛋白、m RNA及RFRP-3m RNA表达明显减少(均P﹤0.05);与老年组比较,温针灸、温和灸、电针组下丘脑组织中Kp、GPR54、GPR147蛋白、m RNA及RFRP-3m RNA表达明显增多(均P﹤0.05);老年组与药物组大鼠下丘脑组织中Kp、GPR54、GPR147蛋白、m RNA及RFRP-3 m RNA表达差异无统计学意义(均P﹥0.05)。各组大鼠垂体组织中Gn RH-R蛋白与m RNA表达差异无统计学意义(P﹥0.05)。与青年组比较,老年组大鼠睾丸组织中Gn RH-R蛋白、m RNA与GPR54蛋白表达明显减少(均P﹤0.05),GPR147蛋白表达明显增多;与老年组比较,温针灸、温和灸、电针组大鼠睾丸组织中Gn RH-R蛋白与m RNA表达明显增多(均P﹤0.05),GPR54蛋白表达明显增多(P﹤0.05),GPR147蛋白表达明显减少(P﹤0.05);老年组与药物组大鼠睾丸组织中Gn RH-R蛋白与m RNA表达差异无统计学意义(均P﹥0.05)。结论1.温针灸、温和灸、电针可延缓老年大鼠睾丸细胞形态基膜增厚、生精细胞脱落、LC退化萎缩的状况,睾酮替代疗法(testosterone replacement therapy,TRT)可导致老年大鼠睾丸LC减少,功能退化。2.老年大鼠血清T、FT含量下降与睾丸LC内Gn RH-R减少有关。温针灸、温和灸和电针通过调控下丘脑KISS-1/GPR54、RFRP-3/GPR147系统,促进Gn RH分泌与睾丸组织内Gn RH-R蛋白与m RNA的表达,Gn RH直接作用于睾丸LC,促进T分泌,发挥延缓衰老的作用。3.温针灸、温和灸、电针与雄激素补充疗法调节血清T、FT水平的作用程度接近,但雄激素并不能明显激活Gn RH合成分泌通路,故温针灸、温和灸、电针更适合在临床中作为长期治疗的方法,且温针灸、温和灸疗效优于电针。