研究目的：　　呼吸道疾病包括急性呼吸道感染和社区获得性肺炎两大类，它是由多种病毒、细菌以及 Q热立克次氏体、肺炎支原体、肺炎衣原体等引起。一直以来，对未知病原体引起的呼吸道疾病进行快速准确诊断不断受到挑战。为了提高快速筛查病原体的能力，需要建立快速、灵敏、准确的具备现场和实验室快速筛查的多种呼吸道病原体的检测技术体系。本研究中PCR-array采用单重实时荧光定量PCR技术，能够在短时间内实现多种呼吸道病毒的同时筛查。针对五种引起急性呼吸道感染的呼吸道病毒，通过构建PCR-array核酸检测技术体系来实现常见呼吸道病毒感染的筛查，为临床诊断提供快速、有效的手段。在PCR-array实验方法基础上，Taqman低密度微流体芯片技术（Taqman Array Cards，TAC）进一步整合了实时定量PCR技术和微流体技术，是一种新兴的多病原体筛查技术。TAC技术是在384孔微流体芯片中固化了针对特定病原体的引物探针，使一份样品可实现多达48种靶标的同时检测，有助于微量样品的多靶标筛查。通过研制基于Taqman低密度微流体芯片（TAC）的28种呼吸道病原体的筛查技术体系，提高快速筛查呼吸道病原体能力，为中国地区呼吸道疾病的监测和爆发调查提供快速、准确、高通量的技术手段。　　研究内容：　　建立针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒 A型、呼吸道合胞病毒B型，以及鼻病毒这五种呼吸道病毒检测的PCR-array实验方法体系。评价并优化研制的五种呼吸道病毒的PCR-array核酸检测实验方法体系，使建立的PCR-array核酸检测实验方法体系检测水平达到：最低检出限10-100copy/反应；与其它相关病原体以及人的基因组无交叉反应；重复性变异系数不大于3％。最后应用临床样本评价PCR-array核酸检测方法体系的灵敏度和特异度，进一步优化使其具有良好的临床检测效果。　　基于上述PCR-array核酸检测体系的实验工作，进一步研制针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、博卡病毒、腺病毒、麻疹病毒等20种病毒，流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等5种细菌以及 Q热立克次氏体、肺炎支原体、肺炎衣原体在内的28种呼吸道病原体检测的Taqman低密度微流体芯片（TAC）。评价并优化研制的28种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片（TAC）技术体系，使其检测水平达到：最低检出限10-100 copy/反应；与其它相关病原体以及人的基因组无交叉反应；重复性变异系数不大于3%，稳定性变异系数不大于10%。最后应用临床样本评价Taqman低密度微流体芯片（TAC）技术的灵敏度和特异度，使其具有良好的临床检测效果。　　研究方法：　　在建立针对五种呼吸道病毒的PCR-array核酸检测实验方法体系中，首先我们查阅相关的参考文献，应用序列比对软件和引物探针设计软件，设计针对5种呼吸道病毒检测的引物探针，并且构建了 PCR-array核酸检测实验方法体系。随后我们设计并构建了针对五种病毒目的基因区域的阳性标准品，应用其评价构建的PCR-array核酸检测实验方法体系的扩增效率、最低检出限以及重复性等指标。最后收集了相应的临床样本，与金标准比较，评价PCR-array核酸检测方法的灵敏度和特异度。　　在建立多种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片（TAC）检测技术研究中，首先查阅大量相关的参考文献，应用序列比对软件和引物探针设计软件，设计并筛选针对28种呼吸道病原体检测的单重实时定量PCR引物和探针（其中与PCR-array相同的5种呼吸道病毒的引物探针相同）。随后，应用来自临床分离株的基因组初步评价引物探针特异性，并且构建了28种呼吸道病原体的阳性标准品（阳性质粒），应用阳性标准品，通过单重实时定量PCR对每种呼吸道病原体的引物探针进行评价。最后，将优化后的28种呼吸道病原体引物、探针固化到384孔板中制成 Taqman低密度微流体芯片（TAC），实现呼吸道病原体的多重检测。进一步应用上述构建的阳性标准品评价了Taqman低密度微流体芯片（TAC）技术体系的最低检测限、重复性和稳定性等指标。最后收集相应的呼吸道病原体的临床样本，以目前临床上常用的方法作为金标准，评价Taqman低密度微流体芯片（TAC）的灵敏度、特异度。　　研究结果：　　针对五种呼吸道病毒的PCR-array核酸检测方法体系研究结果发现：应用构建的五种呼吸道病毒的阳性标准品评价PCR-array核酸检测技术方法有较高的敏感性，最低检出限（LOD）可以达到10copy/μL，扩增效率﹥95%，重复性变异系数﹤3%。与金标准方法相比，在检测临床样本中，PCR-array核酸检测技术方法灵敏度为94.2%，特异度为96%，一致性系数Kappa值为0.7~1.0。　　针对多种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片（TAC）检测技术研究结果发现：应用构建的相应呼吸道病原体的阳性标准品评价28种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片（TAC）检测技术最低检出限为10 copy/μL-100 copy/μL，重复性变异系数﹤3%，稳定性变异系数﹤10%。与临床上常用检测方法即金标准比较，发现28种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片（TAC）检测技术灵敏度为95.2%，特异度为96.6%，一致性系数为0.7~1.0。　　研究结论：　　1.针对五种引起急性呼吸道感染的呼吸道病毒的PCR-array核酸检测技术方法，利用统一的反应条件，能够在短时间内同时实现甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、乙型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒B型的检测，且具有较高的敏感性、灵敏度和特异度。　　2.针对28种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片（TAC）检测技术，充分利用MGB探针检测的优势，克服了以往呼吸道病原体多重检测的缺陷，能够在两小时内对一份样品实现呼吸道病原体的28种呼吸道病原体多靶标检测，且具有良好的灵敏度和特异度。总之，TAC技术是一种快速、准确、高通量的检测方法，这一检测技术为中国地区呼吸道疾病爆发调查和疾病监测提供了一种快速、有效的工具。