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猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)是当前我国广泛流行的猪传染性疾病,是由猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV-2)引起的。其中断奶仔猪最易感,临床表现多以断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)为特点,给我国乃至世界各国的养猪业造成了巨大经济损失。PCV-2引起的猪圆环病毒病目前尚无有效的治疗措施,而且PCV-2对外界抵抗力强,猪场净化难度高。疫苗接种仍然当前防控该病的最有效的手段之一。由于性能稳定、安全性高,灭活疫苗是当前主要的疫苗研发类型,虽然商业化的灭活疫苗已在世界各地养殖场广泛的应用,但其综合免疫效果仍有待提高。本研究首先对PCV-2YZ分离株的繁殖滴度、特异性、毒力、免疫原性等生物学特性进行评价;随后确立了猪圆环病毒2型YZ株的最佳细胞培养条件;进一步建立了 PCV-2YZ株的种子批并完成了各项鉴定;最后筛选和优化疫苗剂型和免疫佐剂,为研制出安全高效的PCV-2灭活疫苗奠定了基础。1.猪圆环病毒2型YZ株生物学特性研究为研究PCV-2 F1代病毒的生物学特性,采用间接免疫荧光法(Indirect fluorescence assay,IFA)测定病毒繁殖滴度,中和试验测定病毒特异性,PCR方法和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)试验测定病毒感染的毒力,进一步通过免疫攻毒保护试验评价该毒株的免疫原性。结果显示:PCV-2YZ株F1代病毒效价为105.48TCID50/ml,并可与PCV-2阳性血清发生特异性反应,中和后感染细胞未见荧光:用F1代病毒对3～5周龄健康易感仔猪肌肉注射和滴鼻病毒液各2.0 ml/头,可使仔猪(5/5)全部发病,出现典型的PCV-2感染相关临床症状及病理变化;将PCV-2F1代毒株制备灭活疫苗,并对健康仔猪(3～5周龄)进行免疫,结果发现,在二免后2 w,该疫苗不仅能提高仔猪体液免疫水平,诱导高效特异性抗体产生,而且能够有效抵抗3株不同来源流行株的攻击,保护率可达100%。以上试验结果表明:PCV-2YZ株F1代各项生物学特性稳定,而且该侯选株对目前的流行毒株具有良好的保护效力,可以作为疫苗株开展进一步的应用。2.猪圆环病毒2型YZ株最佳培养条件优化试验通过对D-氨基葡萄糖浓度、接毒时细胞密度、接种方式、接毒剂量、收毒时间以及收毒方法等一系列条件进行优化,采用间接免疫荧光方法检测病毒滴度,筛选出最佳PCV-2增殖条件。结果显示:以2-4 mmol/LD-氨基葡萄糖加入维持液,待细胞长至单层后按培养液10%的量接毒,37℃培养72 h,细胞及细胞液一起反复冻融后收获,获得的病毒滴度高,能达到105.50 TCID50/ml以上。采用上述最优培养条件分别在扁瓶和转瓶上对PCV-2的培养进行验证,取PCV-2 YZ株F1代病毒连续传5代后分别测其毒价,病毒含量仍不低于105.50 TCID50/ml,证明最佳培养条件可用于工厂化生产。3.猪圆环病毒2型YZ株种子批的建立及鉴定研究为了建立PCV-2(PCV-2)YZ株种子批,将PCV-2 YZ株F1代种毒,在PK-15细胞上连传至30代后分别测定各代次病毒液的TCID50。经测定各代次病毒液效价均稳定在105.0 TCID50/ml以上,且无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染;PCV-2阳性血清均能与PCV-2 YZ株F1、F10、F25、F30代病毒液发生较好的特异性中和反应;各代病毒液经传代后其免疫原性没有发生改变,具有良好的稳定性,根据以上结果确定PCV-2YZ株种毒基础种子批代次为F21代～F25代;生产种子批代次为F26代～F28代,连续继代不超过3代。选择F5-F10代病毒液测定其毒力,以确立强毒标准,同时对各代次病毒液的纯净性、特异性进行检验。结果显示:F5-F8代病毒液具有较强的致病性,可导致4/5头以上攻毒仔猪发病,而F9、F10代病毒液致病性则相对减弱,因此强毒代次定为F5-F8代。4.不同佐剂及剂型的猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备及免疫效力评价选用不同免疫佐剂,同时配合不同剂型,制备PCV-2灭活疫苗(YZ株),随后免疫仔猪后评价各疫苗的免疫效力。制备的灭活疫苗包括:选用10号白油制备油包水(W/O)剂型疫苗;选用ISA206VG佐剂(MontanideTM),制备水包油包水(W/O/W)剂型疫苗;分别选用ISA 15A VG和ISA35 VG佐剂(MontanideTM),制备水包油剂型(O/W)剂型疫苗;选用IMS251CVG佐剂(MontanideTM),制备水(W)剂型疫苗。除白油组外,其余4组疫苗安全性较好。5组疫苗免疫效力试验表明,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗组首免后2 w和3wPCV-2IFA抗体水平显著高于白油(W/O)和IMS251CVG(W)疫苗组(P<0.05);攻毒后猪血清中病毒PCR检测,ISA206VG(W/O/W)疫苗组14d均为阴性,其他免疫组21～28 d转为阴性;猪淋巴结免疫组化检测,ISA 206 VG(W/O/W)、ISA 15A VG(O/W)疫苗组均未出现PCV-2阳性,且该两组中仔猪均未出现连续2d以上的高热症状。以上结果表明,ISA206VG(W/O/W)PCV2灭活疫苗(YZ株)对仔猪具有较好的综合免疫保护效力,可进行后续的临床扩大试验。