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随着全球极端高温天气常发和畜禽集约化养殖的快速发展,热应激给人类健康和畜禽养殖业带来极大威胁。肝脏损伤是热应激造成机体损伤的常见并发症。生脉散(Sheng Mai San,SMS)是中(兽)医益气养阴生脉之代表方剂,对缓解热应激造成的机体损伤具有良好的疗效,但其治疗热应激造成肝脏损伤的报道较少,具体作用机制尚不清楚。本研究以生脉散为研究对象,通过建立体内外热应激致大鼠肝脏损伤模型,系统评价了生脉散对热应激致大鼠肝脏损伤治疗效果,结合靶向能量代谢组学从能量代谢和线粒体功能变化探究了生脉散抗热应激致大鼠肝脏损伤保护机制,为阐明生脉散治疗热应激致肝脏损伤作用机制和临床运用提供理论依据。主要研究方法和结果如下:1、生脉散有效成分测定及体外抗氧化能力评价运用苯酚-硫酸法、亚硝酸钠-硝酸铝法及香草醛-硫酸法测定了生脉散中总多糖、总黄酮和总皂苷含量,结果表明生脉散水提物中总多糖、总黄酮和总皂苷分别占比总提取物的57.41%、0.42%和10.98%;运用HPLC方法测定了生脉散水提物中6种指标性成分,通过系统方法学实验证明所建立的生脉散HPLC测定方法准确可靠,生脉散水提物中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg3、麦冬皂苷D、鲁斯可皂苷元和五味子素A含量分别为76.67±1.44μg/g,461.10±8.46μg/g,298.35±1.48μg/g,52.75±9.36μg/g,134.79±2.42μg/g和248.32±1.21μg/g;通过体外实验系统评价了生脉散体外抗自由基(DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基)和Fe3+还原能力,结果表明生脉散水提物清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基IC50分别为3.280 mg/m L、7.503 mg/m L和4.706 mg/m L,铁氰化钾法其Fe3+还原力线性方程斜率为0.0007179,FRAP法其Fe3+还原力相当于0.0596 mmol Fe SO4/g。2、热应激致大鼠肝脏损伤体内外模型评价建立热应激大鼠模型(38±1℃,75±5%RH,2 h/d),连续7 d和体外BRL-3A细胞模型(43±0.5℃,2 h)。在热应激结束后不同复温时间(0 h,3 h,6 h,9 h,12 h),检测血清生理生化、组织学、氧化应激等指标发现热应激造成大鼠6~12 h血清AST、ALT及AST/ALT比率显著升高(P<0.05),并出现肝脏组织炎性细胞浸润,中央静脉及肝窦充血,空泡变性严重等组织病理学变化,氧化应激产物8-OHd G、MDA显著升高(P<0.05),抗氧化酶CAT显著降低(P<0.05)。体外热应激BRL-3A细胞活力比率也随着复温时间延长,梯度下降(P<0.05),在9 h达到最低点48.25%,细胞ROS含量随着复温时间延长梯度增加(P<0.05)。3、生脉散干预热应激致大鼠肝脏损伤体内外药效学研究采用生脉散高(SMS-H,5.04 g/kg)、中(SMS-M,2.52 g/kg)、低(SMS-L,1.26 g/kg)剂量分别干预热应激大鼠模型,在第7 d热应激结束后6 h评价生脉散对热应激致肝脏损伤保护效果,N-乙酰半胱氨酸(NAC)(150 mg/kg)作为阳性对照。研究表明生脉散能够显著下调热应激大鼠AST、ALT含量及AST/ALT比率(P<0.05),修复肝脏组织结构损伤;提高热应激大鼠肝脏抗氧化防御系统SOD、CAT及GSH含量,抑制氧化应激产物MDA生成(P<0.05);降低热应激大鼠血清和肝脏中MPO含量和肝脏组织炎性细胞因子IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-10 m RNA表达量(P<0.05);抑制由于热应激造成的HSF-1、HSP27、HSP90和HSP70 m RNA过表达(P<0.05)。体外实验证明生脉散能够显著上调热应激造成的BRL-3A细胞活力下降(P<0.05),抑制氧化应激指征ROS含量增加(P<0.05)。4、生脉散干预热应激大鼠肝脏损伤靶向能量代谢组学研究运用UPLC-MS/MS技术测定了各实验组热应激大鼠肝脏40种能量代谢相关物质,并采用RT-q PCR方法对其调控关键酶m RNA表达量进行检测。结果证明,热应激造成肝脏能量代谢紊乱,主要集中于糖酵解和TCA循环等过程,热应激大鼠肝脏组织葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸含量显著降低(P<0.05)。经生脉散干预后,这些物质不同程度回调,且TCA循环如异柠檬酸、琥珀酸及果糖-6-磷酸等显著上调(P<0.05)。热应激大鼠肝脏糖酵解调控关键酶Pklr和Pgk1 m RNA表达量显著下调(P<0.05),生脉散干预后Pklr、Pgk1、Pfk1、Gck m RNA表达量均显著升高(P<0.05)。在TCA循环路径中,生脉散能够显著上调热应激大鼠肝脏Cs、Idh3a、Ogdh、Fh、Sdhb和Mdh2 m RNA表达量,降低Ldha m RNA表达量(P<0.05)。通过PAS染色大鼠肝脏组织,表明生脉散能够抑制热应激造成的大鼠肝脏糖原丢失过多,缓解肝脏糖原代谢紊乱。5、基于AMPK/Drp1路径探究生脉散抗热应激致肝脏损伤作用机理运用透射电镜、蛋白免疫印迹以及荧光探针等技术,结合前期靶向能量代谢组学结果,从线粒体功能和能量代谢角度系统研究了生脉散对热应激致大鼠肝脏损伤保护机制。结果表明,生脉散能够显著缓解热应激大鼠肝脏线粒体肿胀、嵴断裂等线粒体结构损伤,抑制细胞色素C释放到胞质中。体外实验证明生脉散能够显著升高由于热应激造成的线粒体膜电位(?Ψm)降低以及抑制线粒体通透性转换孔(MPTP)开放(P<0.05)。免疫印迹实验证明生脉散能够激活热应激大鼠肝脏AMPKThr172,介导线粒体分裂蛋白Drp1Ser616磷酸化,通过线粒体分裂分离受损的线粒体并诱导线粒体自噬,继而保护肝脏。结论:本研究建立了生脉散有效成分测定质量标准和体外抗氧化能力评价标准。生脉散能够通过修复热应激造成的大鼠肝脏组织病理性损伤、缓解肝脏能量代谢紊乱和维持线粒体结构、功能稳态来治疗热应激造成的肝脏损伤,其中AMPK/Drp1介导的线粒体分裂和线粒体重建过程在其发挥药理药效作用过程中关系密切,为生脉散治疗热应激致肝脏损伤奠定了理论基础。