白介素18（IL-18）是新发现的一种白介素类细胞因子。研究发现：该因子除可以诱导生成IFN-(外，还可与许多细胞因子相互作用，参与机体免疫反应过程，对机体起着重要的免疫调节和保护作用。IL-18主要的生物学活性表现在以下几方面：1）宿主防御功能；2）抗肿瘤免疫；3）前炎因子活性；4）抗变态反应性疾病作用。因此，探讨IL-18不论对基础研究，还是对临床运用方面都具有重要价值。目前，国内外主要集中于IL-18与临床疾病的研究上，IL-18基因的表达、纯化绝大多数局限于原核表达。国内研究IL-18在原核表达体系的表达、纯化的学者不多，对IL-18在真核表达体系中的表达、纯化尚未见报道。本研究旨在探讨IL-18在原核细胞及真核细胞中表达，并探索优化的纯化方法。为以后IL-18的基础研究和临床运用研究奠定良好的基础。第一部分：IL-18在大肠杆菌ER2566中的表达和纯化。利用原核表达体系，是研究IL-18的表达和纯化的第一阶段。通过PCR扩增出IL-18基因，构建原核表达载体pTYB1IL-18，转化入Hananhan法制备的大肠杆菌ER2566超感受态细胞中，然后诱导表达。经过调整温度、摸索异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷诱导浓度以及最佳诱导表达时间等方法得到最佳表达条件。融合蛋白再过柱剪切、纯化，得到IL-18。 本课题为渝教科重点课题基金及重庆医科大学启动基金资助<WP=9>构建的载体pTYB1IL-18通过PCR、酶切鉴定，完全和设计符合，测序结果经Genbank对比与人IL-18序列一致，读码框正确无误。诱导表达后进行SDS-PAGE及Western Blot结果表明在原核表达体系ER2566中成功表达了IL-18融合蛋白。再通过对诱导表达条件的优化，使IL-18融合蛋白，在诱导温度30℃时，pH7，IPTG浓度0.5mM/L，时间4 h的条件下可达到最高表达量。最后，通过IL-18融合蛋白过柱剪切、纯化得到IL-18蛋白。经凝胶成象系统分析：表达蛋白占总蛋白的22%。过柱纯化后得到的IL-18纯化蛋白达90%。第二部分：IL-18在真核毕赤酵母GS115中的表达和纯化。真核表达较原核表达具有独特优势。通过重组PCR和不对称PCR等方法，高效、准确的构建了真核表达载体pPIC9IL-18。构建载体同时考虑加入有利于纯化的intein Tag。intein Tag的加入不仅是在纯化上带来优势，而且也使原核表达产物和真核表达的产物具有可比性，从而不论是在产物的鉴定上还是在实验资源的利用上都具有了巨大的便利。真核酵母GS115采用PEG法制备超感受态。筛选的阳性克隆在优化的诱导条件下诱导表达。表达的蛋白质过柱剪切、纯化，将得到的IL-18再进行活性测定。为了提高IL-18在毕赤酵母中的表达量，利用G418筛选高考贝重组克隆，并采用大片段连接的方法避开相同酶切位点，构建了载体pPIC9KIL-18。构建后的真核载体pPIC9IL-18通过PCR、酶切鉴定，完全和设计符合，测序结果显示：不论是IL-18，还是intein Tag都和理论完全一<WP=10>致，读码框也正确无误。在把载体pPIC9IL-18转化入酵母中时， PEG法制作的酵母感受态，使得转化方便易行，并且转化效率高。运用优化诱导表达的条件使IL-18在真核表达体系中高表达。真核诱导表达的蛋白分别进行SDS-PAGE和Western Blot，其结果也完全达到预期目标。在上清中表达蛋白达12%，纯化后达90%。由于和原核表达体系有相同的intein Tag，真核表达体系的纯化过程与前者是一样的，因此两者的表达产物具有可比性。第三部分：表达的IL-18的生物学活性测定。从外周血中分离提取淋巴细胞，加入分泌表达的IL-18培养，用MTT法进行检测分泌表达的IL-18是否具有生物学活性。IL-18加入外周血淋巴细胞培养，MTT方法检测证明：表达获得的IL-18具有生物学活性。综上所述，本研究成功的在原核细胞大肠杆菌ER2566及真核细胞毕赤酵母GS115中分别表达和纯化了IL-18。表达量均较高，且具有生物学活性。在原核大肠杆菌中，其表达位于细胞内，量较高，但杂蛋白多，大部份表达的IL-18融合蛋白以包涵体的形式存在，少部份以可溶的形式存在于上清液中。真核酵母中表达蛋白直接分泌到上清液中，而GS115自身表达分泌的杂蛋白很少，利于产物纯化，但表达量还可进一步提高。