为明确玉米大斑病菌中黑色素的生物合成途径及其与病原菌致病性间的关系,本论文对玉米大斑病菌黑色素生物合成酶之一的1,3,6,8-四羟基萘还原酶(4HNR)基因进行了克隆、生物信息学分析和功能活性研究,初步明确了4HNR基因的结构特性及其在玉米大斑病菌黑色素合成途径中的作用。根据已知植物病原真菌黑色素生物合成酶基因4HNR的核苷酸序列保守区域设计特异性引物,分别以玉米大斑病菌基因组DNA和cDNA为模板,通过PCR扩增获得了4HNR基因的同源片段,并利用Genomic walking技术得到了4HNR的DNA全长序列。经过DNA序列和cDNA序列对比分析,发现该基因DNA和cDNA全长均为807 bp,没有内含子结构;含有一个完整的开放阅读框架,编码268个氨基酸残基,蛋白的分子量约为28.484 kD,等电点pI 6.52:含有118个疏水性氨基酸残基和150个亲水性氨基酸残基;包含1个完整的3-酮酰基-ACP还原酶活性区域。已经将该基因序列登录到GenBank数据库,获得核苷酸序列登录号为:EU494943,蛋白序列登录号为:ACA52027。利用NCBI中生物信息学软件分析其氨基酸序列与玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene reductase氨基酸序列的同源性为96%,与粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)tetrahydroxynaphthalenereductase氨基酸序列的同源性为78%。制备基因特异探针进行Southern杂交分析,在用基因中不含酶切位点的限制性内切酶进行酶切的产物中均出现1条阳性带,在用基因中含有单个酶切位点的限制性内切酶进行酶切的产物中出现2条阳性带,该结果充分表明,4HNR基因在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝的形式存在。利用Genomic walking技术获得了4HNR基因5’端2 285 bp、3’端301 bp的非编码区,使用国际上通用的启动子分析软件Sofeberry、NNPP对其进行启动子活性区域分析,结果发现,在起始密码子前1000 bp左右范围内有很强的启动子活性结构,其中在34处发现了1个TATA box,-70处发现1个CAAT box,等等。利用毕赤酵母分泌质粒pPIC9K构建了4HNR基因的真核表达载体,电击法及PEG1000介导法转化毕赤酵母菌株GS115进行分泌表达,得到了重组的酵母菌株,从蛋白图谱初步推测出,酵母菌株的上清液中分泌表达了少量目的蛋白。构建了4HNR基因的双交换同源重组型基因敲除载体,利用PEG4000介导法转化玉米大斑病菌的原生质体,共获得了31个潮霉素3代筛选后的阳性转化子,其中有一个菌株呈现灰白色菌落,经PCR验证有清晰的潮霉素扩增条带,初步推测其为突变菌株。本试验从基因克隆、基因表达和基因缺失突变体分析三个方面进行研究,为进一步明确玉米大斑病菌的致病机理、研究基因水平上黑色素对附着胞机械穿透力的调节作用提供理论依据,为新型杀真菌制剂的研制奠定了基础。