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本论文选取了非人灵长类动物--食蟹猴为研究对象,采用组织块贴壁培养法,构建了食蟹猴耳部组织成纤维细胞的体外培养体系,并对其生长特性进行了研究。在建立培养体系的基础上,运用MTT比色法分析了不同浓度表皮生长因子(EGF)、胰岛素(Insulin)和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对5%和10%两种血清浓度下培养细胞增殖能力的影响。
研究结果如下:
1、采用组织块培养法可以获得食蟹猴耳部原代培养物。
2、用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液消化细胞、用含有10%FBS的DMEM对细胞进行培养,细胞在体外传至第25代。3~5次传代后,培养细胞逐渐纯化,为典型的成纤维型细胞,绝大部分呈梭形或不规则三角形。细胞生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走势。
3、用含10%FBS和10%DMSO的DMEM为冷冻液,采取手工冷冻法对细胞进行冷冻保存,冻存浓度为5×106个/ml。通过台盼蓝染色法对不同代数细胞冻存前后活率进行测定,结果发现虽然复苏后存活率有所下降,但均保持在90%以上,传代后细胞形态和生长速度没有明显变化。
4、绘制的细胞生长曲线呈“S”型,细胞生长经历了潜伏期、指数生长期和停滞期,符合体外细胞生长规律。
5、对第10、15、20和25代细胞的染色体倍性进行分析,发现二倍体染色体数为2n=42。虽然随着传代次数的增加,二倍体细胞所占比例有所下降,但仍在80%以上,且四代之间无显著差异。
6、当培养液中血清浓度为5%时,分别添加20~80 ng/ml的EGF、1、5μg/ml的胰岛素、50~100 ng/ml浓度的IGF-I可显著促进细胞增殖。
7、当培养液中血清浓度为10%时,分别添加10~40 ng/ml的EGF、10、15μg/ml的胰岛素、25~100 ng/ml浓度范围内的IGF-I可显著促进细胞增殖。