一、研究目的骨肿瘤是严重威胁人类生命与健康的疾病,包括原发性骨肿瘤和转移性骨肿瘤,其中后者更为常见。骨是恶性肿瘤最常见转移部位之一,约60-80%的恶性肿瘤患者后期会出现骨转移。骨肿瘤患者常常忍受持续性疼痛,面临着病理性骨折、脊髓压迫所致瘫痪等严重的骨相关并发症,大大降低了生存质量,缩短了生存时间。然而,当今针对于骨肿瘤的主要治疗方式尚存在各自的不足:手术治疗创伤大、风险高、术后并发症多,亦不适用于多发性转移患者。同时,骨髓“肥沃的”微环境不仅有利于癌细胞的生长,而且对癌细胞产生保护性的屏障作用,大大降低了常规放、化疗的效率。因此,针对这样一类常见且严重的疾病,我们迫切需要探索并发现更加新型而有效的治疗方式。基于纳米材料的光热治疗因具有针对肿瘤病灶的特异性杀伤和时空上的可控性,而被认为是一种具有前景的骨肿瘤的治疗手段。目前,光热治疗已经在动物水平上证实了对多种肿瘤的可靠疗效。但是,其距离临床应用还有些距离。部分原因在于纳米材料的尺寸太大且难以简单有效地实现材料的多功能化。研究表明,长径超过40nm的材料难以穿透、到达深部肿瘤组织,且难以在治疗后及时地被体内清除,从而产生毒副作用。另外,如果缺少多功能修饰赋予光热材料的辅助成像、靶向递送、协同化疗药物递送等功能带来的协同治疗作用,光热治疗的疗效也显著降低。而实现多功能化往往意味着额外的、复杂的合成步骤,以及材料合成成本的大大提高。再者,由于骨组织渗透性差,通过传统的给药方式,药物很难抵达并积聚于骨肿瘤部位,从而降低了治疗效率。骨靶向性材料的应用可有效地解决治疗效率低这一难题。Yadav等研究发现带负电荷的材料具有一定的主动靶向骨缺损部位的能力,这为设计更加理想的具有自身骨靶向性能的材料提供了新的思路。因此,本课题利用具有可控尺寸及大量的表面功能基团的树形高分子为模板及稳定剂合成具有光热性能与生物相容性的树形高分子-铂纳米颗粒,探索树形高分子末端官能团种类对骨靶向能力的影响,并利用该材料对骨肿瘤进行光热治疗。二、研究方法本课题以末端基团不同的树形高分子作为单分散模板和稳定剂,加入适量K2PtCl6,充分反应后用NaHB4对Pt离子进行还原,合成末端基团分别为羧基(带负电荷)、氨基(带正电荷)和乙酰化氨基(不带电荷)的树形高分子-铂光热纳米材料:g4.5-cooh-pt、g5-nh2-pt和g5-nh2-ac-pt,分别作为实验组和两组对照组。并通过透射电镜(tem)、动态光散射(dls)等方式对三种光热纳米材料进行表征。接下来,本课题通过体外纳米人工骨吸附实验和体内分布实验验证材料的骨靶向性能;体外光照升温实验验证材料的光热性能;细胞毒性实验和血清稳定性实验验证材料的生物相容性。最后,建立裸鼠胫骨肿瘤的动物模型,并分别应用三种光热材料对裸鼠进行光热治疗。整个疗程包括三次光热纳米材料的尾静脉注射,每次注射后于12小时和24小时进行两次10分钟的近红外光照射治疗。通过比对胫骨肿瘤最大周长、治疗前后肿瘤荧光量的变化以及治疗后micro-ct三维重建计算骨体积、骨表面积、骨小梁数及骨小梁间距等相关骨结构参数从而准确比较三种光热纳米材料在骨肿瘤中治疗的疗效差异。三、研究结果(一)具有自身骨靶向能力及多功能潜能的超小光热纳米材料合成及表征我们成功合成末端基团分别为羧基(带负电荷)、氨基(带正电荷)和乙酰化氨基(不带电荷)的树形高分子-铂光热纳米材料:g4.5-cooh-pt、g5-nh2-pt和g5-nh2-ac-pt。tem显示合成的三种光热纳米材料均有相似的形貌和均一的尺寸,直径均介于1-2nm。dls显示三种材料的水合直径均约为10nm,且g4.5-cooh-pt带负电荷,g5-nh2-pt带正电荷,g5-nh2-ac-pt带少量正电荷。(二)具有自身骨靶向能力及多功能潜能的超小光热纳米材料骨靶向性能、光热性能、生物相容性研究体外纳米人工骨吸附实验和体内分布实验均证实g4.5-cooh-pt组吸附骨组织的铂含量远远高于其他两对照组,差异有统计学意义(**p<0.01或***p<0.001)。体外光照升温实验证明三种材料均具有光照转化性能,由于g4.5-cooh-pt组吸附于纳米人工骨的铂含量较其他两组高,因此光照时升温更快,温度更高,照射1分钟后材料温度即上升至45℃,最高温度可达近70℃。细胞毒性实验证实g4.5-cooh-pt和g5-nh2-ac-pt组在在材料浓度为300?m的培养环境中培养,细胞存活率仍高于90%,g5-nh2-pt细胞存活率约80%。血清稳定性实验证明了三种材料溶于50%血清50%pbs溶液中72h后尺寸均无变化。(三)具有自身骨靶向能力及多功能潜能的超小光热纳米材料裸鼠体内光热治疗胫骨肿瘤的研究光热治疗过程中,肿瘤部位温度由高至低依次是G4.5-COOH+NIR组,G5-NH2-AC+NIR组,G5-NH2+NIR组和PBS组。其中G4.5-COOH+NIR组照射后2分钟即可达到最高温度,为45℃(12小时)、44℃(24小时)。G5-NH2-AC+NIR组最高温度为41℃,G5-NH2+NIR组为40℃,PBS组为39℃。治疗结束后,活体荧光成像显示G4.5-COOH+NIR组治疗后的荧光量约为治疗前的2.5倍;而其余对照组治疗后荧光量为治疗前的12.5-15倍(***P<0.001)。胫骨肿瘤最大周长测量及重量称量显示G4.5-COOH+NIR组肿瘤最大周长和重量均远小于其余四组,差异有统计学意义(***P<0.001)。Micro-CT三维重建测定骨参数表明,G4.5-COOH+NIR组裸鼠治疗后平均胫骨体积、平均胫骨表面积、平均骨小梁数量均明显大于其余四组,差异具有统计学意义(**P<0.01或***P<0.001);而平均骨小梁间隔明显小于其余四组,差异具有统计学意义(*P<0.05或**P<0.01)。四、结论我们应用树形高分子和铂纳米颗粒成功合成了超小光热纳米材料。其中末端基团为羧基(带负电荷)的材料:G4.5-COOH-Pt具有优异的光热转换性能、自身骨靶向性能和生物相容性,同时在动物水平上也展示出其针对骨肿瘤的突出的治疗效果。总之,本课题制备出具有自身骨靶向能力及多功能潜能的超小光热纳米材料,并成功应用于骨肿瘤的光热治疗中,为骨肿瘤的治疗的提供了新的有效的治疗方式。