背景皮肤的角化过程也是角质形成细胞(keratinocyte，KC)分化及凋亡的过程。表皮内转谷氨酰胺酶1(transgluteminase 1，TGase 1)可交联细胞膜套(cell envelope)前体蛋白，主要包含内皮蛋白((involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)，还有丝聚蛋白(filaggrin)以及小的富含脯氨酸蛋白(small proline-rich proteins)等的ε-(γ-)谷氨酰—赖氨酸残基而形成加厚的细胞膜套，这种交联十分稳定，可以抵抗蛋白酶的水解作用。TGase 1和内皮蛋白为细胞膜套分化的标志。此外，TGase1也能交联人类内皮蛋白的谷氨酰胺残基和表皮特异的Ω-羟基神经酰胺(Ω-hydroxyceramide)，在二者之间形成酯键，参与脂质膜套(lipid envelope)的形成。脂质膜套也是表皮行使屏障功能的一个关键组分，主要由鞘磷脂(sphingomyelin)与神经酰胺(ceramide)等类脂成分组成。脂质膜套和细胞膜套共同形成具有弹性和可通透性的表皮水屏障，它不但可避免机体必需的水分、离子丢失，而且也有助于KC的正常脱屑。因此，TGase 1是形成和维持表皮水屏障的关键酶。先天性鱼鳞病(congenital ichthyosis)是表型相似、以皮肤呈现大面积粘着的灰褐色片状鳞屑为特征、轻重程度不等的一组疾病。常见的遗传方式为常染色体隐性遗传和显性遗传。1994年Russell等通过对常染色体隐性遗传性鱼鳞病(autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI)患者家系的连锁分析发现其致病基因为TGase 1，定位于染色体14q11。已有研究表明在ARCI患者中，约有1／3为TGase1基因缺陷所致，被称为是经典的板层状鱼鳞病(lamellar ichthysis，LI)患者。2005年Rice等学者通过比较观察ARCI患者与正常人指甲和鳞屑等电镜下和相差光镜的结构发现ARCI患者的细胞膜套结构不完整，可作为TGase 1酶活性缺陷的指标。本研究采取鱼鳞病患者的指甲和鳞屑，以正常人为对照，应用组织化学方法对鳞屑标本进行胆固醇、不饱和脂肪酸和磷脂染色：以Trizol试剂提取指甲蛋白质进行SDS-PAGE；并应用免疫组化方法和免疫印迹观察鳞屑和指甲两者标本的内皮蛋白的表达，进一步分析板层状鱼鳞病患者的基因与表型的关系，为先天性鱼鳞病的临床治疗提供研究基础。材料和方法1．取5例板层状鱼鳞病患者、5例寻常鱼鳞病患者(均经临床诊断证实)和10例正常人的指甲和鳞屑标本，皆密封干燥低温保存。2．将指甲磨碎成粉状，各称量50mg置于Eppendorf管内。以Trizol试剂提取蛋白质，检测蛋白质浓度后进行SDS-PAGE。另取小部分指甲以脱垢剂提取法处理后制备冰冻切片。3．将SDS-PAGE中的目的条带电转膜于硝酸纤维素膜(NCM)上，进行内皮蛋白的免疫印迹。4．对鳞屑铺片和脱垢剂处理过的指甲的冰冻切片进行内皮蛋白的免疫组织化学染色5．制备鳞屑单层铺片标本。以10％福尔马林钙固定后，分别应用丙酮-硫酸尼罗兰法示磷脂、锇酸示不饱和脂肪酸、过氯酸-萘醌法示胆固醇。结果1．指甲的SDS-PAGE电泳图显示在同一蛋白浓度下条带的深浅虽有个体差异，但在带型方面正常人呈现4条主带，分别为63kDa、54kDa、48kDa、38kDa；鱼鳞病患者呈现5条主带，分别是69kDa、63kDa、54kDa、48kDa、38kDa。此外，5例板层状鱼鳞病患者呈现69kDa的OD值高于63kDa的OD值，P＜0.05；而5例寻常鱼鳞病患者的63kDa的OD值均高于69kDa的OD值，P＜0.05。2．指甲的免疫印迹显示63kDa-158kDa的条带呈现内皮蛋白的免疫反应阳性。3．鱼鳞病患者的鳞屑和指甲的标本显示的内皮蛋白免疫组化染色反应强度低于正常对照组，P＜0.05。4．鳞屑铺片显示鱼鳞病患者角质形成细胞的角化膜套均不如正常人的明显可见；此外，磷脂、胆固醇和不饱和脂肪酸含量皆低于正常对照组，P＜0.05小结1．免疫印迹显示指甲内皮蛋白表达的分子量范围位于63kDa-158kDa条带。2．鱼鳞病患者不但内皮蛋白(角化细胞膜套的主要成分)表达下调；而且脂质膜套中类脂含量降低。这提示患者的两种膜套的分化缺陷和屏障功能不良。3．鱼鳞病患者指甲蛋白的SDS-PAGE电泳图比正常者多一条主带。而且板层状鱼鳞病患者个体的69kDa∶63kDa的OD比值高于寻常鱼鳞病患者个体的69kDa∶63kDa的OD比值。这提示可作为区别两种疾病患者的潜在指标。4．板层状鱼鳞病患者的69kDa的过高表达提示与TGase 1的异常有关，也可作为筛选板层状鱼鳞病患者TGase 1酶缺陷与否的参考诊断标志。