论文部分内容阅读
研究背景和目的：热休克蛋白70羰基末端反应蛋白(CHIP)是一个分子伴侣蛋白和含有U-盒子(U-box)的泛素E3连接酶,可促进多种蛋白底物被泛素-蛋白酶体系统降解和清除,在心肌细胞损伤、细胞凋亡、肿瘤、热应急等方面起着重要的作用。但是,CHIP在Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化、凋亡和炎症反应中的作用及机制尚不清楚。因此,本研究主要探讨了CHIP在Ang Ⅱ诱导心肌重塑中的作用及机制。方法：用10周龄野生型小鼠(WT)和心脏特异性过表达CHIP的转基因小鼠(CHIP-TG)各16只,随机分为4组,每组8只：(1)生理盐水(NS)+WT组；(2)NS+CHIP-TG组；(3) Ang Ⅱ+WT组；(4) Ang Ⅱ+CHIP-TG组。采用植入式微量缓释泵给小鼠灌注NS和Ang Ⅱ (1500ng/kg/min),一周后用B超仪检测动物的心脏功能；心脏组织切片进行H&E、Masson染色,分别观察不同组别心脏组织中炎性细胞浸润和胶原沉积的情况；应用免疫组织化学染色检测不同组别心脏中巨噬细胞(Mac2-阳性细胞)数量、单核细胞趋化因子(MCP-1)、血管细胞间粘附分子(ICAM-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原Ⅰ型(Collage Ⅰ)和转化生长因子-β (TGF-β)的表达水平。应用RT-PCR检测不同处理组MCP-1、ICAM-1、 Collage Ⅰ、 TGF-β、白细胞介素-1β(IL-1β)及IL-6的表达水平。应用TUNEL染色方法观察心肌细胞的凋亡情况。应用siRNA-GFP和siRNA-CHIP腺病毒感染原代培养的新生大鼠心肌细胞24小时,然后用Ang Ⅱ (100nM)处理6-24小时,应用RT-PCR及TUNEL染色方法检测不同处理组炎症因子(如MCP-1、ICAM-1、 IL-1β和IL-6)的表达水平及心肌细胞的凋亡情况。另外,原代培养新生大鼠心肌细胞,用丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK) p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的抑制剂刺激0.5小时后再用Ang Ⅱ(100nM)处理6-24小时,分别用RT-PCR和TUNEL染色方法检测IL-1β、IL-6和心肌细胞凋亡的情况。最后,用免疫印记(Western blot)法检测心脏组织及原代培养心肌细胞中p38MAPK、JNK和NF-κB的表达水平。结果：1)在NS处理时,WT和CHIP-TG组心脏功能、病理改变和炎性细胞浸润情况均无明显差别。2) Ang Ⅱ处理7天后,与NS+WT组相比,Ang Ⅱ+WT组的心脏功能、纤维化面积、细胞凋亡情况和炎性细胞的浸润程度均明显增加。3)与Ang Ⅱ+WT组相比,Ang Ⅱ+CHIP-TG组小鼠心脏组织中纤维化面积(Masson染色),α-SMA.Collage Ⅰ和TGF-β表达水平(α-SMA、Collage Ⅰ、 TGF-p免疫组化染色)明显减少；心脏组织中巨噬胞浸润(Mac-2染色)及炎症因子表达水平(MCP-1, ICAM-1IL-1β和IL-6)均明显减少；心肌细胞的凋亡情况(TUNEL)减轻。4)原代培养新生大鼠心肌细胞经Ang Ⅱ处理后显示,与siRNA-GFP对照组相比,siRNA-CHIP感染后可明显上调炎症因子(如MCP-1、ICAM-1、IL-1β和IL-6)的表达及增加心肌细胞的凋亡数量。5) CHIP对Ang Ⅱ引起心肌重塑的保护作用是通过抑制p38MAPK.JNK及NF-κB信号通路的活性而实现的。结论：CHIP通过抑制p38MAPK、JNK及NF-κB信号通路的激活,抑制Ang Ⅱ引起的心肌纤维化、细胞凋亡和炎症反应。