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本课题主要目的：动脉粥样硬化等血管疾病的特点之一是内膜中异常积聚了大量的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)。研究发现,异常积聚的VSMCs中过氧化物酶体增殖活化受体Y(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, PPAR-γ)表达明显增加,但关于PPAR-γ表达的上游调节因子却知之甚少。本实验旨在体外研究探索致VSMCs增殖的同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)对PPAR-γ表达的影响及可能机制。本课题主要方法：1.血管平滑肌细胞的体外培养体外分离人脐动脉VSMCs,用含10%胎牛血清的DMEM培养基对VSMCs进行体外培养。通过抗平滑肌细胞α-肌动蛋白抗体免疫细胞化学分析法鉴定VSMCs纯度。将血清饥饿至少24小时的长至80%～90%融合的3～4代VSMCs用于以下实验。2.同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞增殖的作用应用MTT法,检测不同浓度的HCY作用0～48小时对VSMCs增殖的作用及不同浓度的N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)预孵育0～24小时对VSMCs增殖的作用。3.同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞中PPAR-γ表达的影响应用抗PPAR-γ抗体免疫细胞化学方法检测不同浓度的同型半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸对VSMCs中PPAR-γ蛋白表达的作用。应用逆转录聚合酶链式反应检测不同浓度的HCY及N-乙酰半胱氨酸预孵育对VSMCs中PPAR-γmRNA表达的影响。本课题主要结果：1.MTT结果显示HCY刺激24小时对VSMCs增殖有明显促进作用,48小时获得最大值,且随着HCY浓度的增加而增加。在此基础上,应用不同浓度的抗氧化剂预孵育6小时发现,NAC对HCY诱导的VSMCs增殖有部分抑制作用,24小时获得最大值,且也有浓度和时间依赖趋势。2.抗PPAR-γ抗体免疫细胞化学分析结果显示,0.10mmol/LHCY刺激48小时使正常VSMCs中微量表达的PPAR-γ蛋白阳性表达率明显增加,且有浓度依赖趋势。不同浓度的NAC预孵育24小时后发现,HCY诱导的PPAR-γ阳性表达被明显抑制。3. RT-PCR半定量分析结果显示,HCY作用2小时就可使VSMCs中PPAR-γmRNA表达明显增加,24小时获得最大值,48小时虽然有所下降,但仍高于正常水平。NAC预孵育12小时发现,HCY诱导的PPAR-γmRNA表达被明显抑制,但24小时时表达仍高于正常水平。与免疫细胞化学分析结果基本一致,NAC使HCY诱导的PPAR-γmRNA表达明显下调,也呈现浓度和时间依赖趋势。本课题主要结论：结合MTT、免疫细胞化学和半定量RT-PCR分析实验结果,我们得出以下结论：1.同型半胱氨酸对VSMCs增殖和PPAR-γ表达均有诱导作用,且存在时效差异我们的实验结果表明HCY对VSMCs增殖和PPAR-γmRNA表达均有诱导作用,且存在时效差异：随着HCY作用时间的延长,HCY对PPAR-γmRNA表达的诱导作用逐渐下调,而对血管平滑肌细胞增殖的诱导作用逐渐增强并占据主导地位。2.同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞增殖有双重作用由于活化的PPAR-γ对多种因子诱导的VSMCs增殖的抑制作用已被大量实验证实,所以我们的实验结果表明HCY对VSMCs细胞有双重作用,即在诱导增殖占主导地位的同时,HCY通过活化细胞中的PPAR-γ,对VSMCs增殖又起到了一定的负反馈调节作用。3.氧化应激是同型半胱氨酸诱导VSMCs增殖和PPAR-γ表达的作用机制之一抗氧化剂NAC预孵育结果显示,NAC对HCY诱导的VSMCs增殖和PPAR-Y表达均有部分抑制作用,表明氧化应激是HCY的作用机制之一。