放射治疗(RT)已被推荐用于治疗不可切除的局部晚期肝细胞癌(HCC),放射性肝病(RILD)是阻碍肝癌放疗疗效提高的主要并发症。多数HCC患者伴有乙型肝炎病毒(HBV)感染等所有能继发肝纤维化的基础疾病,而这些基础疾病也与RILD密切相关。Toll样受体4 (TLR4)不仅在HBV感染及相关肝损伤中起重要的免疫作用；而且,理论上,也可被放疗相关组织破坏产生的内源性损伤信号分子所激活,释放致炎因子,促进放射性损伤。另外,肝脏组织间隙液(TIF),作为一特殊的微环境,在肝损伤过程中起着细胞间信息通讯的作用。改变微环境可影响肝细胞的放射敏感性。为此,本研究主要探讨TLR4、HBV活化是否改变肝TIF,进而影响RILD,寻找早期诊治RILD的新靶点。第一部分基于螺旋断层立体定向放疗,建立小鼠放射性肝病模型及相关正常组织剂量限量目的：螺旋断层立体定向放射治疗(HT-SBRT)构建小鼠放射性肝病(RILD)模型,探索HT-SBRT诱导显著小鼠RILD的确切剂量和危及器官的剂量限量。材料和方法：30只小鼠按肝脏及危及器官阶梯放疗剂量随机分组,使用螺旋断层放疗仪(TOMO)对小鼠肝脏等行HT-SBRT治疗。观察小鼠体力状况评分(MPS)、体重减轻、柏油样血便等情况,检验血清中谷草转氨酶(AST)／谷丙转氨酶(ALT)/白蛋白水平,检测小鼠肝脏及危及器官的病理改变。建立肝脏和相关危及器官放射性损伤的病理评价标准,并对小鼠各器官放射损伤的严重程度进行评分。结果：小鼠全肝接受放疗剂量≥31.76+1.94 Gy的HT-SBRT治疗,可诱发显著放射性肝病,建立小鼠RILD模型。同时,确立相关危及器官的放疗剂量限量,例如：肺,V20≤20.3%；肾脏,V10≤11.3%；肝脏：平均剂量<26.36±1.71 Gy；胃肠道,最大剂量<22.63 Gy等。另外,初步定义小鼠腹部HT-SBRT相关副反应评价标准：MPS>1.5±0.56,体重下降>0±0.89g,AST/ALT>589.2±118.5/137.4±15.3 U/L,血清白蛋白≤18.8+0.99g/L。结论：基于小鼠腹部放疗相关危及器官剂量限量及副作用评价标准的确立,利用HT-SBRT可以成功建立小鼠RILD模型,这有利于今后在HT-SBRT治疗肝细胞癌等腹腔肿瘤等方面的深入研究。第二部分TLR4免疫,而非HBV活化,促进小鼠放射性肝病目的：Toll样受体4(TLR4)可触发乙型肝炎病毒(HBV)感染及肝损伤中的关键免疫反应。HBV活化或TLR4免疫则可能是防治肝癌放疗并发症——放射性肝病(RILD)的重要靶点。材料与方法：本研究分为两阶段。第一阶段,运用高压水注射法以含完整HBVDNA的pAAV/HBW质粒感染TLR4缺陷(TLR4-)小鼠后,对感染或不感染HBV的TLR4-小鼠行全肝30 Gy放疗；同时,设立对照组不行全肝放疗。第二阶段,对TLR4正常(TLR4+)小鼠行全肝放疗,比较其与TLR4-小鼠放疗后RILD的差异；研究小鼠全肝放疗后HBV活化、TLR4免疫和RILD严重程度之间的相关性。结果：放疗可以促进HBV活化；但无论有、无HBV放疗后活化,TLR4-小鼠全肝放疗不出现显著RILD。然而,TLR4+小鼠全肝放疗可诱导显著RILD, TLR4+小鼠的RILD评分(2±0.27)高于TLR4-小鼠(0.5±0.19),P<0.05。结论：放疗可以促进HBV活化；但RILD的严重程度与小鼠TLR4免疫相关,与HBV活化无关。第三部分TLR4免疫改变小鼠肝组织间隙液(微环境),促进放射性肝病目的：探讨Toll样受体4(TLR4)免疫和肝组织间隙液(TIF)在防治肝脏放疗继发放射性肝病(RILD)中的作用机制。材料与方法：本研究包括两阶段。初步研究阶段,予以TLR4缺陷(TLR4-)和TLR4正常(TLR4+)小鼠全肝30 Gy放疗。20天后提取肝脏TIF,并使用小鼠蛋白抗体芯片检测,分析肝TIF内蛋白变化与TLR4免疫、RILD严重程度之间的关系。验证阶段,原代分离培养TLR4+及TLR4-小鼠肝细胞,6MV-X线照射后8 Gy后,分别与第一阶段提取的TIF共培养。流式细胞仪进行肝细胞凋亡相关检测。结果：伴随肝TIF内GM-CSF、TRAIL和VEGFR-2的高表达,TLR4+小鼠较TLR4-小鼠更易出现显著RILD, P<0.05。TLR4+和TLR4-小鼠肝细胞放疗后与TLR4+小鼠全肝放疗后提取的肝TIF共培养,两者的凋亡率均显著高于与TLR4-小鼠全肝放疗后的TIF及未放疗小鼠的TIF共培养的肝细胞,P<0.05。结论：TLR4免疫提高TIF(即肝脏微环境)中GM-CSF、VEGFR-2和TRAIL的表达,促进RILD。第三部分TLR4免疫改变小鼠肝组织间隙液(微环境),促进放射性肝病目的：探讨Toll样受体4(TLR4)免疫和肝组织间隙液(TIF)在防治肝脏放疗继发放射性肝病(RILD)中的作用机制。材料与方法：本研究包括两阶段。初步研究阶段,予以TLR4缺陷(TLR4-)和TLR4正常(TLR4+)小鼠全肝30 Gy放疗。20天后提取肝脏TIF,并使用小鼠蛋白抗体芯片检测,分析肝TIF内蛋白变化与TLR4免疫、RILD严重程度之间的关系。验证阶段,原代分离培养TLR4+及TLR4-小鼠肝细胞,6MV-X线照射后8 Gy后,分别与第一阶段提取的TIF共培养。流式细胞仪进行肝细胞凋亡相关检测。结果：伴随肝TIF内GM-CSF、TRAIL和VEGFR-2的高表达,TLR4+小鼠较TLR4-小鼠更易出现显著RILD, P<0.05。TLR4+和TLR4-小鼠肝细胞放疗后与TLR4+小鼠全肝放疗后提取的肝TIF共培养,两者的凋亡率均显著高于与TLR4-小鼠全肝放疗后的TIF及未放疗小鼠的TIF共培养的肝细胞,P<0.05。结论：TLR4免疫提高TIF(即肝脏微环境)中GM-CSF、VEGFR-2和TRAIL的表达,促进RILD。第四部分临床分析放疗后手术肝癌患者TLR4、TLR4及相关蛋白对放射性肝病的影响目的：临床研究HBV活化、TLR4免疫、TLR4相关蛋白在人类放射性肝病(RILD)中的作用和机制,进一步验证在小鼠研究中获得相关结论,促进基础实验研究成果到临床应用的快速转换。材料与方法：回顾分析放疗后行手术切除肝癌的我院28例患者的病史及病理资料。石蜡包埋保存的手术病理标本中,放疗剂量为35-48 Gy的癌周肝组织被用于构建组织芯片,行免疫组化染色和HE染色检查；研究人类肝脏放疗时,HBV活化、TLR4免疫、TLR4相关蛋白和RILD严重程度之间的关系。结果：相对于肝脏HBsAg高表达或TLR4低表达病例,肝TLR4高表达者易于出现显著RILD病理改变。在肝脏放疗后HBV活化的12例病人中,TLR4高表达的病例仅占2例；而在9例无放疗后HBV活化的病人中,却有6例病人肝脏TLR4高表达(P<0.03)。此外,相对于肝脏TLR4低表达,TLR4高表达病例肝脏内TRAIL、EGFR-2和GM-CSF的表达水平显著升高,促进RILD (P< 0.05)。结论：在临床上,也是TLR4免疫,而非HBV活化,显著影响RILD。肝癌放疗中,肝脏TLR4高表达不仅可以抑制HBV活化,而且可以促进肝内TRAIL、 VEGFR-2和GM-CSF的表达,进而诱导严重RILD。